引言
近年来，毒理学实验室面临大量新精神活性物质快速涌现的检测压力。NPS是一类统称，指代各类未受管制的物质或制剂，其研发目的通常为模拟违禁及管制药物的药理作用。该类物质因暂未纳入法律管控范畴，也常被称作 “合法兴奋剂”。NPS涵盖多类别精神类物质，包含兴奋剂、阿片类物质、大麻素、致幻剂等多种品类。部分此类化合物虽被冠以 “新型” 之名，实则并非近年全新合成。多数化合物早年便已完成合成制备，相关研究曾探索其潜在药用价值，但受各类因素限制未能获批上市，如今却再度流入市场，成为滥用类物质。
尽管NPS暂不受法律管制，但被普遍认为是一种公共健康威胁。该类物质的滥用可引发各类健康损伤，甚至造成药物过量中毒。然而，由于NPS更新迭代速度极快，绝大多数此类物质的药理作用、安全剂量及药物间相互作用均缺乏完善的研究数据支撑。
NPS的泛滥，给开展毒理学检测与查扣毒品检验工作的实验室带来了特殊难题。伴随NPS种类持续增加，实现该类物质的检出、定性与定量分析已成为实验室刚需。尽管该目标明确清晰，但多种因素会大幅增加检测分析工作的难度。首先，NPS品类数量庞大，目前已鉴定出数百乃至上千种相关化合物，给筛查工作造成阻碍。其次，各类NPS的流行周期更迭速度极快，实验室难以实时掌握当下流通泛滥的目标物质。除此之外，多数该类化合物为新近出现物质，此前并未作为成瘾性消遣药物流通，因此在初次送检样品时难以快速识别。在实际案件样本中，某种药物往往在实验室人员尚未察觉时便已存在，这意味着检测工作从一开始就几乎总是处于滞后状态。针对NPS开发全新检测方法，还存在周期长、技术难度高、研发成本高昂等问题。综合各类制约条件，NPS检测方法的开发是一项繁重艰巨的工作。充分明晰NPS给实验室带来的各类难点，有助于科研人员针对性开展该类物质检测方法的研发工作。
本文将梳理NPS检测过程中需兼顾的实操要点与分析技术要点，并针对其中一类阿片类NPS展开检测方法开发探讨。
NPS 的实用与分析注意事项
化学结构
NPS 涵盖多种毒品类别下的大量化合物，各类物质化学结构差异显著，对应的理化性质也因此大相径庭。与之相对，同一亚类下的毒品多为彼此的化学类似物，分子结构具备高度相似性。
芬太尼（Fentanyl）于 1960 年首次人工合成，早期广泛应用于临床镇痛治疗。但该物质后续逐渐泛滥成为主流滥用毒品，引发大量药物过量致死案例。非法芬太尼制造者开始制造结构经过修饰的芬太尼类似物，以规避管制。乙酰芬太尼（Acetyl fentanyl）就是这类类似物之一。芬太尼含有苯丙酰胺基团，而乙酰芬太尼含有苯乙酰胺基团，二者分属不同化合物，但结构上极为相似。这对依赖化学与结构差异来有效鉴别和分离化合物的分析技术（如 LC-MS/MS）具有重要影响。
在进行 NPS 方法开发时，关注异构体和同量异位素等问题至关重要，有助于为有效分析选择最佳分析条件，包括色谱柱、流动相组成、检测器、温度及其他因素的选择。
流行态势
待筛查化合物种类繁多，且各类NPS在非法毒品市场中的流通占比存在不确定性，实验室难以判定需重点检测的NPS，相关筛选工作存在较大盲目性。目前已有权威信息渠道可为实验室提供参考，便于科研人员明确各阶段优先筛查的目标物质。法医科学研究与教育中心（CFSRE）、美国缉毒局（DEA）以及国家法医实验室信息系统（NFLIS）均提供有关新 NPS 发现情况及特定化合物检出频率的信息。在开展 NPS 方法开发时查阅这些资源，有助于确保将最重要的化合物纳入分析物清单。
基质考量
与所有毒理学或药物化学分析一致，在为 NPS 开发方法时应考虑样品的基质。如果对生物体液进行毒理学检测，则母体化合物以及任何已知代谢物都可能被纳入分析物清单。部分代谢产物在生物体内的留存周期长于母体药物，即便样品中已无法检出母体药物，仍可检出对应代谢物。因此在生物体液分析中，代谢物对于确认用药至关重要。若检测方法开发面向查扣毒品物证定性场景，代谢产物的检测价值则远低于生物体液检验场景。
设计类苯二氮䓬类药物氯硝唑仑就是一个例子。该物质作为一种新型精神活性物质，于2014年首次出现在非法药物供应中。目前已知其代谢物为8-氨基氯硝唑仑。对于缴获的药物物证鉴定，仅检测氯硝唑仑的母体化合物即可满足要求；但如果是对死后血液样本进行毒理学分析，则必须同时检测氯硝唑仑及其代谢物8-氨基氯硝唑仑。由此可见，在构建新型精神活性物质检测清单时，充分考虑检材基质以及代谢物分析的必要性，是至关重要的一环。
采用 LC-MS/MS 分析尼秦类（Nitazenes）的方法开发
背景
苯并咪唑类阿片（Benzimidazole-opioids），俗称尼秦类（nitazenes），是近年非法毒品市场中新出现的合成阿片类子类。该类化合物药效强度存在差异，但药理活性与其余阿片类物质相近，能够引发呼吸抑制作用。自该类物质重新流入市面后，现已鉴别出多种结构类似物。此类化合物以苯并咪唑环为核心骨架，其 1 号位连接乙胺基团，2 号位连接苄基；各类尼秦衍生物均通过对该基础分子骨架进行结构修饰得到，且后续仍会不断涌现全新结构类似物。
图 1：尼秦类基本结构与已知结构类似物 [1]
 | R1 | R2 | R3 | R4 | |
| metonitazene | NO2 | OCH3 | CH2CH3 | CH2CH3 | |
| metodesnitazene | H | OCH3 | CH2CH3 | CH2CH3 | |
| etonitazene | NO2 | OCH2CH3 | CH2CH3 | CH2CH3 | |
| etodesnitazene | H | OCH2CH3 | CH2CH3 | CH2CH3 | |
| protonitazene | NO2 | OCH2CH2CH3 | CH2CH3 | CH2CH3 | |
| butonitazene | NO2 | OCH2CH2CH2CH3 | CH2CH3 | CH2CH3 | |
| isotonitazene | NO2 | OCH(CH3)2 | CH2CH3 | CH2CH3 | |
| clonitazene | NO2 | CI | CH2CH3 | CH2CH3 | |
| flunitazene | NO2 | F | CH2CH3 | CH2CH3 | |
| etonitazepyne | NO2 | OCH2CH3 | -CH2CH2CH2CH2– | ||
| etonitazepipne | NO2 | OCH2CH3 | -CH2CH2CH2CH2CH2– | ||
该类结构药物的首次合成可追溯至 20 世纪 50 年代，相关合成初衷为探究其镇痛药理作用，彼时该类药物尚未获批应用于人体临床 [1]。在此后的数十年间，其中一些化合物出现在非法药物市场，异丙托尼秦于 2019 年初在美国境内被发现 [2]。
2020 年，DEA 宣布计划将 异丙托尼秦列入《受管制物质法》附表 I，以减少相关用药过量死亡人数 [2]。尽管如此，近年来新的尼秦类似物仍不断渗入非法药物市场。直到近期，被鉴定出的大多数类似物仍属于原始专利文献所记载的范围。诸如 N-吡咯烷基依托尼秦 等尼秦类似物的出现标志着该子类进入了新阶段。此类物质并未被早期研究文献收录，属于真正意义上新近合成的NPS [2]。这一现象表明，该类药物并不会在短期内被取缔消亡，反而会持续发生结构演变并愈发泛滥。这类化合物也印证了既往合成药物可依托NPS的形式再度流通，并不断衍生出结构同源的新型类似物。
图 2：尼秦类出现的时间线
本研究强烈建议，开展毒理学与药物化学分析的实验室将尼秦类化合物纳入常规检测筛查范围。本文后续部分将讨论一组尼秦类化合物的方法开发过程。
制定分析物清单
目前已知的尼秦类（nitazene）类似物数量相当可观，但并非所有类似物都已在非法药物市场中广泛流通。一种策略是建立能覆盖所有已知尼秦类化合物的检测方法，但这样会导致分析时间延长，并且需为标准品投入更多经费，而其中很多化合物在实际案件样品中出现的可能性极低。更高效的做法是参考前述文献资源，了解当前哪些尼秦类化合物最为常见，有针对性地建立方法。截至本文撰写时，以下尼秦类被列为检测范围推荐项：N-去乙基异托尼秦、异丙托尼秦、N-吡咯烷基依托尼秦、N-吡咯烷基丙托尼秦、N-吡咯烷基甲托尼秦、丙托尼秦和异丁托尼秦[3]。
所开发方法的预期用途是尿液样品的毒理学分析。多种尼秦类药物的通用代谢物 4-羟基尼秦已在包括血液和尿液在内的多种体液中被检出 [2]。检出该代谢物可指示尼秦类的使用，因此也被加入分析物清单。
图 3：用于方法开发的尼秦类清单
Isotonitazene
(410.5 g/mol)
N-Pyrrolidino etonitazepyne
(394.5 g/mol)
Protonitazene
(410.5 g/mol)
N-Pyrrolidino metonitazene
(380.4 g/mol)
iso-Butonitazene
(424.5 g/mol)
N-Pyrrolidino protonitazene
(408.5 g/mol)
N-Desethyl-isotonitazene
(382.5 g/mol)
4′-hydroxy Nitazene
(368.4 g/mol)
HPLC 色谱柱与流动相选择
HPLC 色谱柱品类繁多，筛选适配新分析方法的色谱柱存在较大选择难度。C18 与联苯（Biphenyl）固定相为药物检测实验室的主流选型，可作为该类分析场景的优先固定相。绝大多数管制精神药品均可通过 C18、联苯型色谱柱高效分析，二者各具优势。
固定相筛选过程中需综合考量目标化合物的分子结构与理化性质。若待测组分包含同分异构体，合适的色谱柱是实现异构体对有效分离、避免二者共流出的关键。就本次方法开发所选的尼秦类而言，全部八种化合物结构极为相似，并包含一对异构体。异丙托尼秦和丙托尼秦 互为异构体，二者仅在苄基部分对位的取代上存在结构差异。鉴于各目标待测物结构相似度极高，选用可提供充足分离度的色谱柱具有重要意义。
Raptor Biphenyl 色谱柱是分离此类难分离化合物的理想选择。该柱采用核壳颗粒技术以获得高柱效，并因增强的 π-π 相互作用而在难分离场合提供更高的选择性。本方法开发选用了 Raptor Biphenyl 50 x 2.1 mm, 2.7 µm 色谱柱（货号9309A52）。为保护色谱柱免受尿液基质中颗粒物或污染物的影响，使用了 Raptor Biphenyl EXP 保护柱芯 5 x 2.1 mm, 2.7 µm（货号 9309A0252，需搭配EXP保护柱套使用，柱套货号25808）。
甲醇和乙腈都是 HPLC 中常用的有机相，本方法对二者均进行了考察。如前所述，π-π 相互作用有助于联苯相实现更佳的分离。甲醇结构中不含 π 电子，因此当其作为有机流动相与联苯固定相色谱柱配合使用时，可使固定相的 π-π 相互作用得以发生，从而增强分离；相反，乙腈结构中含有带 π 电子的—CN，会削弱联苯固定相的 π-π 相互作用。为此，流动相 A 选用水、流动相 B 选用甲醇，二者均以 0.1% 甲酸酸化。
方法开发与优化
在 Shimadzu 8045 LC-MS/MS 上对每种分析物的 MRM 离子对进行了优化，详见下表。
表 I：尼秦类化合物的 MRM 离子对（ESI+）
| Peak | Ion Mode | Precursor | Product Ion | Product Ion |
| 4′-hydroxy Nitazene | ESI+ | 369.1 | 100.2 | 72.3 |
| iso-Butonitazene | 425.2 | 100.3 | 72.2 | |
| Isotonitazene | 411.0 | 100.2 | 72.2 | |
| N-Desethyl isotonitazene | 383.0 | 72.3 | 312.2 | |
| N-Pyrrolidino etonitazene | 395.0 | 98.3 | 56.1 | |
| N-Pyrrolidino metonitazene | 381.0 | 98.2 | 121.2 | |
| N-Pyrrolidino protonitazene | 409.0 | 98.3 | 56.2 | |
| Protonitazene | 411.0 | 100.2 | 72.2 |
使用上述色谱柱、流动相和 MRM 离子对开发了一种 LC-MS/MS 方法。对洗脱梯度、流速和柱温进行了优化，以获得分析物的最佳分离。方法优化完成后，将分析物加标于空白尿液中，以确认不存在基质干扰。
最终方法
最终方法参数、代表性谱图和分析物保留时间如下所示。
表 II：尼秦类 LC-MS/MS 方法参数
色谱柱:
保护柱:
流动相 A:
流动相 B:
流速:
梯度程序:
Raptor Biphenyl 50 x 2.1 mm, 2.7 µm (cat.# 9309A52)
Raptor Biphenyl EXP 保护柱芯 5 x 2.1 mm, 2.7 µm（cat.# 9309A0252）
水中 0.1% 甲酸
甲醇中 0.1% 甲酸
1.0 mL/min
时间 (min)
0.00
3.50
4.25
5.00
5.50
6.00
%A
72
50
0
0
72
72
%B
28
50
100
100
28
28
柱温:
进样体积:
稀释剂:
40 °C
10 µL
水中 0.1% 甲酸（MPA）
图 4：所开发的尼秦类分析方法——尿液基质中的代表性谱图
表 III：分析物保留时间
| Analyte # | Analyte | Retention Time (min) |
| 1 | 4′-hydroxy Nitazene | 0.94 |
| 2 | N-Pyrrolidino metonitazene | 2.03 |
| 3 | N-Pyrrolidino etonitazene | 2.69 |
| 4 | N-Desethyl isotonitazene | 2.94 |
| 5 | Isotonitazene | 3.36 |
| 6 | N-Pyrrolidino protonitazene | 3.53 |
| 7 | Protonitazene | 3.67 |
| 8 | iso-Butonitazene | 4.12 |
本研究所建立的最终检测方法总运行时长为六分钟。该方法成功分离了全部八种尼秦类化合物，包括那对异构体。虽然鉴定出一处尿液干扰，但其与所有目标分析物均实现了良好分离。所有分析物均在五分钟内洗脱，末尾另有一分钟的柱再平衡时间。
所开发的方法快速有效，可在六分钟内完成八种尼秦类化合物的分析。所有分析物（包括一对关键组分）均得到充分分离。该方法非常适合含尼秦类化合物样品的毒理学或药物化学分析。
借助 Pro EZLC 谱图模拟软件精简 NPS 方法开发
方法开发工作耗时长、成本高，还会占用仪器机时与人力等资源。再加上 NPS 化合物所带来的紧迫性和不确定性，方法开发尤为繁重。Pro EZLC 是一款虚拟液相色谱模拟软件，可用于开发和优化液相方法，而无需在实验室投入实际操作时间。Pro EZLC 软件可用于比较固定相、色谱柱尺寸、流动相及其他影响分离的参数 [4]。其“Drugs of Abuse”（滥用药物）化合物库包含最新的 NPS 清单，其中就有上文讨论的尼秦类化合物。
尽管不同仪器之间的保留时间预计会存在一些差异，但 Pro EZLC 软件能够准确预测保留时间。为展示预测值与实测值的接近程度，对所开发的尼秦类方法进行了模拟，并将实测保留时间与预期保留时间进行了比较。
图 5：由 Pro EZLC 软件生成的尼秦类方法模拟谱图
表 IV：Pro EZLC 预测的尼秦类方法保留时间与峰标注
| Analyte | tR (min) | RS | Peak Width (min) | Exit %B | Mode | Precursor Ion | Quantifier Product Ion | |
| 1 | 4′-hydroxy Nitazene | 0.90 | 0.064 | 30.5 | + | 369.1 | 100.2 | |
| 2 | N-Pyrrolidino metonitazene | 2.14 | 0.076 | 38.2 | + | 381.0 | 98.2 | |
| 3 | N-Pyrrolidino etonitazene | 2.81 | 0.077 | 42.4 | + | 395.0 | 98.3 | |
| 4 | N-Desethyl isotonitazene | 3.09 | 0.076 | 44.1 | + | 383.0 | 72.3 | |
| 5 | Isotonitazene | 3.58 | 4.7 | 0.074 | 47.2 | + | 411.0 | 100.2 |
| 6 | N-Pyrrolidino protonitazene | 3.70 | 0.075 | 48.0 | + | 409.0 | 98.3 | |
| 7 | Protonitazene | 3.92 | 0.072 | 49.3 | + | 411.1 | 100.3 | |
| 8 | iso-Butonitazene | 4.23 | 0.036 | 62.4 | + | 425.2 | 100.3 |
表 V：Pro EZLC 软件预测（预期）保留时间与观测保留时间的比较
| Peak # | Analyte | Expected tR (min) | Observed tR (min) | Difference (sec) | % Difference |
| 1 | 4′-hydroxy Nitazene | 0.90 | 0.94 | 2.4 | 4.44% |
| 2 | N-Pyrrolidino metonitazene | 2.14 | 2.03 | 6.6 | 5.14% |
| 3 | N-Pyrrolidino etonitazene | 2.81 | 2.69 | 7.2 | 4.27% |
| 4 | N-Desethyl isotonitazene | 3.09 | 2.94 | 9.0 | 4.85% |
| 5 | Isotonitazene | 3.58 | 3.36 | 13.2 | 6.14% |
| 6 | N-Pyrrolidino protonitazene | 3.70 | 3.53 | 10.2 | 4.59% |
| 7 | Protonitazene | 3.92 | 3.67 | 15.0 | 6.37% |
| 8 | iso-Butonitazene | 4.23 | 4.12 | 6.6 | 2.60% |
对比结果显示，Pro EZLC 软件生成的谱图与实验数据高度吻合。所有分析物的保留时间差值均≤15 s，平均相对偏差为 4.80%。软件模拟结果与仪器实测结果的组分出峰顺序、分离度（含同分异构体分离效果）保持一致。Pro EZLC 色谱模拟软件实用性较强，可缩短NPS检测方法的开发周期，并简化相关研发流程。
参考文献
- Drug Enforcement Administration, Drug & Chemical Evaluation Section, Benzimidazole-opioids, (November 2022) https://www.deadiversion.usdoj.gov/drug_chem_info/benzimidazole-opioids.pdf
- S. Walton, et al., A forward-thinking approach to addressing the new synthetic opioid 2-benzylbenzimidazole nitazene analogs by liquid chromatography–tandem quadrupole mass spectrometry (LC–QQQ-MS), J. Toxicol. 46 (3), Oxford UP (2021) 221–31. https://doi.org/10.1093/jat/bkab117.
- Center of Forensic Science Research & Education, Recommended scope for NPS testing in the United States: Q2 2022 (2022) https://www.cfsre.org/images/scoperecommendations/Q2-2022-NPS-Scope-Recommendations-NPS-Discovery-072522.pdf.
- Restek Corporation, Pro EZLC software simplifies LC method development, Video, https://www.restek.com/videos/pro-ezlc-software-simplifies-lc-method-development.
