{"id":43548,"date":"2020-10-21T00:00:00","date_gmt":"2020-10-21T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/discover.restek.com\/uncategorized\/migliora-lanalisi-dellacrilammide-negli-alimenti-con-colonne-lc-di-lunga-durata-e-standard-interni-convenienti\/"},"modified":"2026-01-28T22:07:41","modified_gmt":"2026-01-28T22:07:41","slug":"migliora-lanalisi-dellacrilammide-negli-alimenti-con-colonne-lc-di-lunga-durata-e-standard-interni-convenienti","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/discover.restek.com\/it\/articoli\/ffar3126-it\/migliora-lanalisi-dellacrilammide-negli-alimenti-con-colonne-lc-di-lunga-durata-e-standard-interni-convenienti","title":{"rendered":"Migliora l\u2019analisi dell\u2019acrilammide negli alimenti con colonne LC di lunga durata e standard interni convenienti"},"content":{"rendered":"\n

L\u2019acrilammide pu\u00f2 formarsi nei prodotti alimentari dalla reazione tra gli zuccheri e l\u2019amminoacido asparagina durante le preparazioni ad alta temperatura, come la frittura e la cottura alla griglia, arrosto o al forno. Alimenti come le patatine, i prodotti da forno a base di cereali e il caff\u00e8 sono esempi di prodotti che sono stati cruciali per determinare la presenza e la concentrazione dell\u2019acrilammide. La rilevazione dell\u2019acrilammide negli alimenti \u00e8 stata documentata per la prima volta nel 2002 dall\u2019ente nazionale svedese per gli alimenti, e da allora si sono profusi sforzi sempre maggiori sul piano internazionale per comprenderne meglio l\u2019origine nei prodotti alimentari per il consumo umano e animale, il livello di contaminazione nei vari alimenti e i potenziali effetti sulla salute legati all\u2019esposizione alimentare. L\u2019acrilammide \u00e8 classificata come sostanza chimica estremamente pericolosa ed \u00e8 stato dimostrato che in grandi quantit\u00e0 pu\u00f2 essere cancerogena negli animali da laboratorio (sebbene a oggi non sia stato dimostrato alcun collegamento diretto fra l\u2019esposizione alimentare e una maggiore incidenza del cancro sull\u2019uomo). Al fine di tutelare la salute pubblica, gli scienziati hanno bisogno di metodi pi\u00f9 efficienti per determinare in modo accurato la concentrazione di acrilammide in alimenti e bevande. Qui mettiamo a confronto i tipici metodi di analisi dell’acrilammide in prodotti alimentari e un processo migliorato che utilizza una colonna Allure Acrilammide e uno standard interno deuterato. Tra i vantaggi vi sono tempi di analisi pi\u00f9 rapidi e un aumento della produzione di campioni senza che venga meno l\u2019idoneit\u00e0 del sistema.<\/p>\n\n\n\n

Approccio analitico attuale<\/h2>\n\n\n\n

La LC-MS\/MS \u00e8 la tecnica che va per la maggiore<\/h3>\n\n\n\n

L\u2019analisi accurata dell\u2019acrilammide nelle matrici alimentari ha presentato alcune sfide tecniche. Inizialmente, per le separazioni GC sono state utilizzate tecniche di rilevazione in spettrometria di massa perch\u00e9 l\u2019acrilammide \u00e8 un composto piccolo e relativamente volatile. Queste tecniche si basavano per\u00f2 sulla conversione dell\u2019acrilammide in un derivato bromurato, un passaggio che sarebbe meglio evitare [1]. In seguito sono state vagliate le tecniche LC-MS\/MS, che ora rappresentano lo strumento analitico pi\u00f9 comune nelle analisi di routine dell\u2019acrilammide nei campioni alimentari. Ma i metodi LC-MS\/MS affrontano ancora delle difficolt\u00e0 analitiche, in particolare nella ritenzione selettiva dell\u2019acrilammide e nella sua separazione dai composti co-estratti dalle matrici complesse che vengono tipicamente analizzate.<\/p>\n\n\n\n

Utilizzare colonne LC con carbonio grafitato poroso (PGC)<\/h3>\n\n\n\n

L\u2019Europa ha formalizzato il metodo EN 16618:2015 per l\u2019analisi dell\u2019acrilammide negli alimenti, che prevede l\u2019utilizzo di precolonne e colonne analitiche LC contenenti carbonio grafitato poroso (PGC); uno dei motivi \u00e8 il fatto che i meccanismi tradizionali di ritenzione a fase inversa (RP) presentano delle difficolt\u00e0 nell\u2019analisi dell\u2019acrilammide. Ora le colonne PGC sono comunemente utilizzate nel settore perch\u00e9 riescono a trattenere l\u2019acrilammide a sufficienza per separarla dai componenti della matrice che possono essere stati co-estratti, anche dopo la procedura di preparazione del campione piuttosto rigorosa delineata dal metodo EN. La colonna PGC \u00e8 in grado di operare anche in fasi mobili al 100% acquose, una condizione in cui molte colonne RP andrebbero incontro al fenomeno detto \u201cdewetting\u201d, che comporterebbe una perdita del tempo di ritenzione e la necessit\u00e0 di rigenerare la colonna con un lungo risciacquo con una fase mobile al 100% organica.<\/p>\n\n\n\n

Utilizzare standard interni deuterati<\/h3>\n\n\n\n

Nonostante una quantificazione accurata sia importantissima, il processo di estrazione pu\u00f2 dare luogo a una variazione considerevole; proprio per questo motivo, il metodo EN raccomanda di aggiungere al campione degli standard interni insieme al solvente di estrazione. Il metodo EN prevede di utilizzare standard interni deuterati anzich\u00e9 quelli marcati sul carbonio, anch\u2019essi comunemente utilizzati per l\u2019analisi dell\u2019acrilammide. Molto meno costosa rispetto all\u2019acrilammide marcata sul carbonio, l\u2019acrilammide-d3 \u00e8 un\u2019alternativa eccellente ed economicamente vantaggiosa quando si tratta di scegliere gli standard interni.<\/p>\n\n\n\n

Requisiti del metodo<\/h3>\n\n\n\n

Il tempo necessario per l\u2019analisi dell\u2019acrilammide negli alimenti con il metodo EN 16618:2015 \u00e8 di 8 minuti. Per soddisfare i requisiti di idoneit\u00e0 del sistema, l\u2019acrilammide non deve eluire prima di 1,7 minuti, ma il tempo successivo all\u2019eluizione \u00e8 necessario per il risciacquo dalla colonna dei componenti della matrice, rimasti nell\u2019estratto del campione anche dopo il processo SPE di preparazione del campione in due fasi previsto dal metodo EN. Le colonne PGC mostrano una forte ritenzione dei componenti della matrice, e se questi non vengono drenati a sufficienza fra un\u2019analisi e l\u2019altra possono pregiudicare la prestazione al punto di non consentire la ritenzione in 1,7 minuti come richiesto dal sistema.<\/p>\n\n\n\n

Ritornare a una ritenzione a fase inversa pu\u00f2 aumentare la produzione di campioni<\/h2>\n\n\n\n

Utilizzando le colonne PGC, i laboratori si avvicinano al limite di idoneit\u00e0 del sistema e si trovano di fronte a una scelta: proseguire con la lunga procedura di rigenerazione della colonna, sperando di recuperare i requisiti di idoneit\u00e0, oppure sostituire la precolonna in uso e probabilmente anche la colonna analitica. Entrambe le opzioni richiedono tempo e denaro e interrompono la produzione di campioni. Passare a una colonna Allure Acrilammide \u00e8 un\u2019alternativa migliore: la chimica a fase inversa brevettata incorpora un unico ligando polare che \u00e8 in grado di trattenere l\u2019acrilammide, \u00e8 compatibile con condizioni al 100% acquose e, rispetto alle colonne PGC, offre tempi di corsa inferiori e una maggiore durata della colonna. Utilizzare una precolonna e una colonna analitica Allure Acrilammide offre un equilibrio imbattibile in quanto consente di trattenere l\u2019acrilammide abbastanza a lungo da soddisfare i requisiti di idoneit\u00e0 del sistema EN, ma allo stesso tempo non trattiene i composti della matrice co-estratti al punto da non riuscire a risciacquarli rapidamente dalla colonna tra un\u2019analisi e l\u2019altra. I laboratori che adottano le colonne Allure Acrilammide possono quindi analizzare un maggior numero di campioni utilizzando meno colonne: un fattore di risparmio non da poco per qualsiasi laboratorio di sicurezza alimentare. Gli esempi riportati di seguito mostrano i vantaggi che i laboratori di sicurezza alimentare a elevata produttivit\u00e0 possono trarre dall\u2019uso di una precolonna e una colonna Allure Acrilammide insieme a standard interni deuterati.<\/p>\n\n\n\n

Tempi di analisi pi\u00f9 brevi<\/h3>\n\n\n\n

Poich\u00e9 i composti della matrice eluiscono velocemente dalla colonna Allure Acrilammide, questa \u00e8 in grado di equilibrarsi ed essere pronta per l\u2019iniezione successiva pi\u00f9 in fretta perfino rispetto a una colonna PGC in condizioni ottimali. La figura 1 illustra un esempio di due metodi diversi per l\u2019analisi dell\u2019acrilammide nei prodotti alimentari (in questo caso nelle patatine): un metodo utilizza la colonna Allure Acrilammide e l’altro una colonna PGC esemplificativa. Il metodo con la colonna PGC \u00e8 stato ulteriormente ottimizzato rispetto al metodo EN, riducendo il tempo di analisi da 8 a 7 minuti, pur mantenendo il risciacquo ottimale della colonna e il tempo di equilibratura. Nessun tipo di risciacquo ulteriore ha mostrato vantaggi significativi sulla durata della colonna. L\u2019analisi dell\u2019acrilammide sulla colonna Allure Acrilammide ha soddisfatto il requisito di metodo della ritenzione in 1,7 minuti con una buona separazione dai componenti della matrice, ma con tempi di equilibratura molto pi\u00f9 brevi. Con un risparmio per ogni analisi di 2,5 minuti rispetto al metodo EN 16618:2015 e di 1,5 minuti rispetto al metodo ottimizzato con colonna PGC, Allure Acrilammide consente di analizzare un maggior numero di campioni a ogni turno, aumentando la produzione del laboratorio.<\/p>\n\n\n

Figura 1<\/strong>: Adottando la colonna Allure Acrilammide, i laboratori possono aumentare la produzione di campioni in quanto \u00e8 richiesto un tempo di equilibratura pi\u00f9 breve rispetto a una colonna PGC, anche su una matrice complessa come le patatine.<\/div>
\n
\"Comparison:<\/div>

LC_FS0532<\/p>

Peaks<\/h4>\n
<\/th>Peaks<\/th>Conc.
(ng\/mL)<\/th>		Precursor<\/th>Product<\/th><\/tr><\/thead>\n
1.<\/td>Acrylamide-d3 (IS)<\/td>200<\/td>75.1<\/td>58.1<\/td><\/tr>\n
2.<\/td>Acrylamide<\/a><\/td>Endogenous<\/td>72.1<\/td>55.1<\/td><\/tr>\n<\/tbody><\/table><\/div>

Conditions<\/h4>
Column<\/th>See notes<\/td><\/tr>
<\/td>
Temp.:<\/th>22 \u00b0C<\/td><\/tr>
Standard\/Sample<\/th>Acrylamide-d3<\/td><\/tr>\n
Diluent:<\/th>Water<\/td><\/tr><\/td><\/tr>
Inj. Vol.:<\/th>10 \u00b5L <\/td><\/tr>
Mobile Phase<\/th>A. 0.001% Formic acid in water, B. 0.001% formic acid in acetonitrile<\/td><\/tr>
Flow:<\/th>0.4 mL\/min<\/td><\/tr><\/table>
Detector<\/th>MS\/MS<\/td><\/tr>
Ion Mode:<\/th>ESI+ <\/td><\/tr>
Mode:<\/th>MRM <\/td><\/tr>
Instrument<\/th>HPLC<\/td><\/tr>
Sample Preparation<\/th>Extracted per EN 16618:2015

Weighed 2.0 g of homogenized potato chips into a 50 mL centrifuge tube. Added 40 mL water followed by the addition of internal standard. Shook by hand for 30 sec, by vortexer for 15 sec, and then on a mechanical shaker for 60 min set to maximum sample extraction agitation. Centrifuged in a refrigerated centrifuge at 10 \u00b0C, 3600 x g for 20 min. Removed the aqueous layer after centrifugation, taking care to avoid the top, fatty layer, or the solids at the bottom of the tube. Placed the aqueous extract in an appropriate container.

For cleanup, the first SPE cartridge (multimode SPE column with nonpolar, SAX, and SCX properties, 1000 mg\/6 mL) was conditioned with 3 mL methanol and x2, 6 mL aliquots of water. Passed 10 mL of the aqueous extract through the column and collected eluate. For the next cleanup step, the second SPE cartridge (crosslinked polystyrene\/poly-DVB SPE column, 500 mg\/6 mL) was conditioned with 5 mL methanol and 5 mL water. Passed the eluate from the previous step entirely through the column. Rinsed the loaded cartridge once with 4 mL water and discarded the rinsing solvent. Eluted the acrylamide with 2 mL of 60% methanol in water. Collected the sample and transferred into an evaporation tube. Placed the tube in an evaporator at a temperature no higher than 40 \u00b0C to remove the methanol. Evaporated until the final volume was 0.5\u20130.8 mL using a gentle flow of nitrogen. Transferred the final sample into an autosampler vial and analyzed by LC-MS\/MS.<\/td><\/tr>
Notes<\/th>Column Details<\/b>
A. Allure Acrylamide column<\/i>: 5 \u03bcm, 50 mm x 2.1 mm ID analytical column (cat.# 9167552<\/a>) with 5 \u03bcm, 10 mm x 2.1 mm ID guard cartridge (cat.# 916750212<\/a>).
B. Porous graphitized carbon column<\/i>: 5 \u03bcm, 50 mm x 2.1 mm ID analytical column with 5 \u03bcm, 10 mm x 2.1 mm ID guard cartridge.

Mobile Phase Gradients (%B)<\/b>
A. Allure Acrylamide column<\/i>: 0.00 min (0%), 1.00 min (0%), 2.00 min (90%), 2.01 min (0%), 5.50 min (0%), flow = 0.4 mL\/min.
B. Porous graphitized carbon column<\/i>: 0.00 min (0%), 1.70 min (0%), 2.70 min (90%), 2.71 min (0%), 7.00 min (0%), flow = 0.4 mL\/min.
<\/td><\/tr><\/table><\/div><\/div><\/div>
<\/path><\/g><\/path><\/g><\/svg>Download PDF<\/a><\/div><\/div><\/div>\n<\/div><\/div><\/div>\n\n\n

Maggiore durata delle colonne<\/h3>\n\n\n\n

La figura 2 illustra l\u2019ottima stabilit\u00e0 dei tempi di ritenzione dell\u2019acrilammide ottenuti con la colonna Allure Acrilammide rispetto a una colonna PGC esemplificativa, che invece mostra una perdita di ritenzione quasi immediata e infine, dopo 475 iniezioni di un campione di caff\u00e8, estratto e purificato seguendo il metodo EN 16618:2015, non riesce pi\u00f9 a rispettare il requisito del tempo di ritenzione di 1,7 minuti. Anche dopo 1000 iniezioni, invece, le prestazioni di Allure Acrilammide sono rimaste stabili e pronta per l\u2019iniezione successiva. La figura\u202f3 mostra che la cromatografia sulla colonna Allure Acrilammide \u00e8 rimasta invariata dalla prima alla millesima iniezione. La sua capacit\u00e0 di eluire – e non trattenere fortemente – i composti della matrice co-estratti \u00e8 la chiave per ottenere prestazioni estremamente stabili su centinaia e centinaia di ripetizioni di iniezioni di matrice, richiedendo poca se non nessuna manutenzione.<\/p>\n\n\n

Figura 2<\/strong>: La colonna Allure Acrilammide soddisfa i requisiti di idoneit\u00e0 del sistema EN\u00a016618:2015 anche dopo 1000 iniezioni, oltre il doppio delle iniezioni consentite da una tipica colonna PGC.<\/div>
\n