{"id":45316,"date":"2021-11-29T00:00:00","date_gmt":"2021-11-29T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/discover.restek.com\/uncategorized\/troubleshooting-lc-riconoscere-e-risolvere-i-cali-di-prestazione\/"},"modified":"2025-12-31T15:28:59","modified_gmt":"2025-12-31T15:28:59","slug":"troubleshooting-lc-riconoscere-e-risolvere-i-cali-di-prestazione","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/discover.restek.com\/it\/articoli\/gnar3485-it\/troubleshooting-lc-riconoscere-e-risolvere-i-cali-di-prestazione","title":{"rendered":"Troubleshooting LC: riconoscere e risolvere i cali di prestazione"},"content":{"rendered":"\n<ul class=\"wp-block-list\">\n<li>Consigli per ripristinare la stabilit\u00e0 della linea di base.<\/li>\n\n\n\n<li>Linee guida per diagnosticare e risolvere i problemi comuni relativi al picco.<\/li>\n\n\n\n<li>Procedure di lavoro ottimali per gestire la contropressione del sistema.<\/li>\n<\/ul>\n\n\n\n<p>Ogni strumento e ogni metodo prima o poi presenta un calo delle prestazioni, per cui \u00e8&nbsp;necessario effettuare un troubleshooting LC, la cui premessa fondamentale \u00e8 capire cosa significa avere un cromatogramma \u201cnormale\u201d. Documentando accuratamente le prove di qualifica degli strumenti, gli interventi di manutenzione e i risultati dei test di idoneit\u00e0 del sistema \u00e8 possibile creare un elemento di confronto fondamentale per definire gli intervalli normali e scoprire l\u2019origine dei problemi. Per esempio, ripetere un test di accuratezza della velocit\u00e0 di flusso e confrontarlo con i valori precedenti pu\u00f2 aiutare a comprendere se un problema di velocit\u00e0 di flusso \u00e8 la causa principale delle variazioni del tempo di ritenzione. In questo articolo affronteremo i problemi comuni legati alla variazione della linea di base, ai picchi cromatografici e alla pressione del sistema, suggerendo strategie concrete per risolverli. Attieniti a queste linee guida generali unitamente ai manuali delle attrezzature e alle procedure operative standard del tuo laboratorio per rimettere in funzione il tuo strumento in modo veloce ed efficace.<\/p>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading\">Ripristinare la stabilit\u00e0 della linea di base<\/h2>\n\n\n\n<p>Nei laboratori LC non \u00e8 raro trovare una linea di base instabile. La variazione pu\u00f2 essere causata da diversi fattori, e determinare se esiste uno schema pu\u00f2 aiutare a stabilirne l\u2019origine (Figura 1). Una linea di base irregolare \u00e8 probabilmente causata da una perdita o una bolla d\u2019aria, quindi per stabilizzarla dovrebbe essere sufficiente controllare tutti i raccordi, accertarsi del funzionamento del degasatore e spurgare il sistema con una fase mobile nuova. Se utilizzi un rilevatore UV, una linea di base rumorosa pu\u00f2 anche indicare che \u00e8 ora di cambiare la cella di flusso o la lampada del rivelatore. Se invece le variazioni della linea di base sono regolari, pu\u00f2 essere un problema della pompa o del pistone, e la manutenzione ordinaria di queste parti dovrebbe risolvere il problema. Infine, se nel complesso la linea di base ha un cattivo aspetto, si consiglia una pulizia approfondita del sistema. Si ricorda che anche le variazioni della temperatura ambiente possono causare fluttuazioni della linea di base, quindi le prestazioni possono essere ripristinate anche utilizzando un fornetto per colonne o isolando la colonna e le linee.<\/p>\n\n\n<div class=\"wp-block-custom-chromatogram-article-top\"><div class=\"chromatogram-article-placeholder\"><div class=\"figure-heading\"><strong>Figura 1:<\/strong>\u00a0Linee di base anomale che si incontrano comunemente durante il troubleshooting LC.<\/div><div class='chromatogram-article-inner-full'><div class=\"chromatogram-article-inner\">\n<style>.kb-image45316_33b898-85 .kb-image-has-overlay:after{opacity:0.3;}<\/style>\n<div class=\"wp-block-kadence-image kb-image45316_33b898-85\"><figure class=\"aligncenter size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"1024\" height=\"591\" src=\"https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/\/figure-article-GNAR3485-01-1-1024x591.jpg\" alt=\"\" class=\"kb-img wp-image-69575\" title=\"-\" srcset=\"https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-01-1-1024x591.jpg 1024w, https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-01-1-300x173.jpg 300w, https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-01-1-768x443.jpg 768w, https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-01-1-1536x887.jpg 1536w, https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-01-1.jpg 1800w\" sizes=\"auto, (max-width: 1024px) 100vw, 1024px\" \/><\/figure><\/div>\n\n<\/div><\/div><\/div>\n\n\n<div style=\"height:20px\" aria-hidden=\"true\" class=\"wp-block-spacer\"><\/div>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading\">Troubleshooting relativo al picco<\/h2>\n\n\n\n<p>Il troubleshooting relativo al picco \u00e8 necessario sia nel corso dell\u2019analisi ordinaria che durante lo sviluppo del metodo, ma le variazioni ammesse in queste due situazioni sono diverse. I problemi legati a forme del picco di bassa qualit\u00e0, ridotta sensibilit\u00e0 e scarsa ritenzione che si sviluppano nel tempo in un metodo consolidato, indicano che si \u00e8 verificata una variazione (per esempio: perdita nell\u2019impianto, degradazione della fase mobile, contaminazione della precolonna, ecc.), ma un\u2019opportuna manutenzione dovrebbe consentire di ripristinare le prestazioni. Tuttavia alcuni dei suggerimenti illustrati di seguito, quali l\u2019aggiunta di un tampone alla fase mobile o la modifica della temperatura della colonna, non dovrebbero essere messi in pratica durante l\u2019analisi ordinaria, perch\u00e9 potrebbero richiedere un\u2019ulteriore validazione prima dell\u2019implementazione.<\/p>\n\n\n\n<p>Al contrario, i problemi relativi al picco riscontrati durante lo sviluppo del metodo indicano che possono essere necessarie ulteriori variazioni dei parametri del metodo, e vi sono maggiori opportunit\u00e0 di miglioramento rispetto a quelle offerte da un metodo consolidato. Durante lo sviluppo del metodo, oltre a seguire le linee guida per il troubleshooting LC sotto riportate, \u00e8 possibile ottimizzare il metodo di preparazione del campione, la fase stazionaria della colonna e le condizioni analitiche per le matrici e i composti da analizzare. Quando si effettuano modifiche per migliorare i picchi cromatografici, \u00e8 importante innanzitutto comprendere quali fattori possono o non possono essere modificati in base alle procedure operative standard del laboratorio.<\/p>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading\">Migliorare le forme del picco di bassa qualit\u00e0<\/h3>\n\n\n\n<p>Picchi alti e simmetrici migliorano l\u2019accuratezza e la sensibilit\u00e0, ma numerosi fattori possono causare lo scodamento (tailing), il fronting, lo sdoppiamento e l\u2019allargamento dei picchi. Questi tipi di distorsioni del picco comportano spesso altri problemi, quali la variazione dei tempi di ritenzione o la coeluizione. Se si osservano forme del picco distorte durante l\u2019analisi ordinaria o lo sviluppo del metodo, i consigli per il troubleshooting LC riportati nella Tabella I aiutano a diagnosticare il problema sulla base dei segnali visibili nel cromatogramma.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Tabella I<\/strong>: Consigli per il troubleshooting LC per migliorare la forma del picco.<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-table\"><table class=\"has-fixed-layout\"><tbody><tr><td><strong>Segno<\/strong><\/td><td><strong>Causa<\/strong><\/td><td><strong>Soluzione<\/strong><\/td><\/tr><tr><td rowspan=\"7\"><strong>Scodamento dei picchi<\/strong><img decoding=\"async\" src=\"https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/chart-article-GNAR3485-01.jpg\" alt=\"\" title=\"-\"><strong><\/strong><\/td><td>Sovraccarico della colonna<\/td><td>Iniettare una quantit\u00e0 inferiore di massa (diluire il campione o ridurre il volume di iniezione). Si ricorda che il volume di iniezione \u00e8 limitato dalle dimensioni della colonna. Le linee guida generali per intervalli accettabili sono indicate di seguito:<br><strong>ID colonnaVolume (\u00b5L)<\/strong>2.1 mm (lunghezza 30 -100 mm)1-33.0-3.2 mm (lunghezza 50-150 mm)2-124.6 mm (lunghezza 50-250 mm)8-40<\/td><\/tr><tr><td>Colonna usurata o degradata<\/td><td>Sebbene opportuni accorgimenti consentano di massimizzare la durata della colonna LC, le colonne sono consumabili che prima o poi devono essere sostituiti. Prestazioni cromatografiche di scarsa qualit\u00e0 possono essere il segnale che \u00e8 giunto il momento di sostituire la colonna. Ma prima di procedere in tal senso \u00e8 opportuno cercare di rigenerarla seguendo la procedura descritta nella Tabella II.<\/td><\/tr><tr><td>Contaminazione<\/td><td>Preparare nuove soluzioni per escludere il rischio di soluzioni degradate o preparate in modo errato.<br><br>Sciacquare la colonna analitica seguendo la procedura di pulizia raccomandata dal produttore.<br><br>Sostituire regolarmente le precolonne, accertandosi che corrispondano alla fase della colonna analitica<br><br>.In caso di utilizzo di analizzatori MS, assicurarsi di utilizzare solventi e additivi di grado LC-MS.<\/td><\/tr><tr><td>Interazioni con il silanolo sulla superficie della silice<\/td><td>Aggiungere un tampone alla fase mobile (ripartendo equamente la componente acquosa e quella organica) per bloccare i siti attivi sulla superficie della silice.<br><br>La soluzione tampone pu\u00f2 essere preparata mescolando un acido debole con il sale della sua base coniugata. Quando si utilizza l\u2019acido formico, usare il formiato di ammonio per tamponare la soluzione, mentre quando si utilizza l\u2019acido acetico, usare l\u2019acetato di ammonio.<\/td><\/tr><tr><td>Componenti della matrice interferenti\/coeluenti<\/td><td>Analizzare uno standard preparato in solvente per confronto.Filtrare gli estratti del campione.Valutare l\u2019aggiunta o la modifica della procedura di preparazione del campione per produrre estratti pi\u00f9 puliti.<\/td><\/tr><tr><td>Eccessivo volume del&nbsp;sistema<\/td><td>Ridurre il volume del sistema utilizzando sezioni di tubo pi\u00f9 corte o tubi con diametro interno inferiore per minimizzare la dispersione del picco. Quando si sostituisce il tubo, \u00e8 importante realizzare connessioni corrette assicurandosi che il tubo e la ferrula siano completamente inseriti nell\u2019entrata della colonna.<\/td><\/tr><tr><td>Connessioni instabili<\/td><td>Assicurarsi che il tubo e la ferrula siano completamente inseriti nell\u2019entrata della colonna.<img decoding=\"async\" src=\"https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/chart-article-GNAR3485-01a.jpg\" alt=\"decorative\" title=\"-\"><\/td><\/tr><tr><td rowspan=\"6\"><strong>Fronting dei picchi<\/strong><img decoding=\"async\" src=\"https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/chart-article-GNAR3485-02.jpg\" alt=\"decorative\" title=\"-\"><strong><\/strong><\/td><td>Incompatibilit\u00e0 tra i solventi (probabile soprattutto in caso di fronting dei picchi a&nbsp;eluizione rapida)<\/td><td>Diluire il campione in una composizione del solvente uguale (o pi\u00f9 debole) rispetto alla composizione della fase mobile iniziale. Cercare di far corrispondere sia il rapporto tra la componente acquosa e quella organica sia la forza del tampone.<\/td><\/tr><tr><td>Colonna usurata o degradata<\/td><td>Sebbene opportuni accorgimenti consentano di massimizzare la durata della colonna LC, le colonne sono consumabili che prima o poi devono essere sostituiti. Prestazioni cromatografiche di scarsa qualit\u00e0 possono essere il segnale che \u00e8 giunto il momento di sostituire la colonna. Ma prima di procedere in tal senso \u00e8 opportuno cercare di rigenerarla seguendo la procedura descritta nella Tabella II.<\/td><\/tr><tr><td>Contaminazione<\/td><td>Preparare nuove soluzioni per escludere il rischio di soluzioni degradate o preparate in modo errato.Sciacquare la colonna analitica seguendo la procedura di pulizia raccomandata dal produttore.Sostituire regolarmente le precolonne, accertandosi che corrispondano alla fase della colonna analitica.In caso di utilizzo di analizzatori MS, assicurarsi di utilizzare solventi e additivi di grado LC-MS.<\/td><\/tr><tr><td>Sovraccarico della colonna<\/td><td>Iniettare una quantit\u00e0 inferiore di massa (diluire il campione o ridurre il volume di iniezione). Si ricorda che il volume di iniezione \u00e8 limitato dalle dimensioni della colonna. Le linee guida generali per intervalli accettabili sono indicate di seguito:<strong>ID colonna<\/strong><strong>Volume (\u00b5L)<\/strong>2.1 mm (lunghezza 30 -100 mm)1-33.0-3.2 mm (lunghezza 50-150 mm)2-124.6 mm (lunghezza 50-250 mm)8-40<\/td><\/tr><tr><td>Componenti della matrice interferenti\/coeluenti<\/td><td>Analizzare uno standard preparato in solvente per confronto.Filtrare gli estratti del campione.Valutare l\u2019aggiunta o la modifica della procedura di preparazione del campione per produrre estratti pi\u00f9 puliti.<\/td><\/tr><tr><td>Connessioni instabili<\/td><td>Assicurarsi che il tubo e la ferrula siano completamente inseriti nell\u2019entrata della colonna.<img decoding=\"async\" src=\"https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/chart-article-GNAR3485-01a.jpg\" alt=\"decorative\" title=\"-\"><\/td><\/tr><tr><td rowspan=\"3\"><strong>Sdoppiamento dei&nbsp;picchi<\/strong><img decoding=\"async\" src=\"https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/chart-article-GNAR3485-03.jpg\" alt=\"shape, arrow, rectangle\" title=\"-\"><\/td><td>Incompatibilit\u00e0 tra i solventi<\/td><td>Diluire il campione in una composizione del solvente uguale (o pi\u00f9 debole) rispetto alla composizione della fase mobile iniziale.&nbsp;<\/td><\/tr><tr><td>Problema di solubilit\u00e0<\/td><td>Assicurarsi che il campione sia completamente solubile sia nel solvente del campione che nella fase mobile per impedire la precipitazione.<\/td><\/tr><tr><td>Contaminazione<\/td><td>Preparare nuove soluzioni per escludere il rischio di soluzioni degradate o preparate in modo errato.Sciacquare la colonna analitica seguendo la procedura di pulizia raccomandata dal produttore.Sostituire regolarmente le precolonne, accertandosi che corrispondano alla fase della colonna analitica.In caso di utilizzo di analizzatori MS, assicurarsi di utilizzare solventi e additivi di grado LC-MS.<\/td><\/tr><tr><td rowspan=\"12\"><strong>Picchi ampi<\/strong><img decoding=\"async\" src=\"https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/chart-article-GNAR3485-04.jpg\" alt=\"decorative\" title=\"-\"><strong><\/strong><\/td><td>Sovraccarico della colonna<\/td><td>Iniettare una quantit\u00e0 inferiore di massa (diluire il campione o ridurre il volume di iniezione). Si ricorda che il volume di iniezione \u00e8 limitato dalle dimensioni della colonna. Le linee guida generali per intervalli accettabili sono indicate di seguito:<strong>ID colonna<\/strong><strong>Volume (\u00b5L)<\/strong>2.1 mm (lunghezza 30 -100 mm)1-33.0-3.2 mm (lunghezza 50-150 mm)2-124.6 mm (lunghezza50-250 mm)8-40<\/td><\/tr><tr><td>Variazione della concentrazione della fase&nbsp;mobile<\/td><td>Realizzare una nuova fase mobile e mantenerla tappata per impedirne l\u2019evaporazione o la contaminazione.<\/td><\/tr><tr><td>Velocit\u00e0 di flusso troppo&nbsp;bassa<\/td><td>Aumentare la velocit\u00e0 di flusso della fase mobile.<\/td><\/tr><tr><td>Dispersione del picco nell\u2019iniettore<\/td><td>Utilizzare un loop di campionamento pi\u00f9 piccolo.<\/td><\/tr><tr><td>Ritenzione troppo elevata<\/td><td>Utilizzare una fase stazionaria meno ritentiva.Provare a eseguire un\u2019eluizione a gradienteSe si utilizza un metodo isocratico, aumentare la forza della fase mobile.Modificare la composizione del tampone.<\/td><\/tr><tr><td>Volume della cella del rilevatore troppo grande o&nbsp;tempo di risposta troppo lungo<\/td><td>Utilizzare una cella pi\u00f9 piccola e\/o ridurre il tempo di risposta.<\/td><\/tr><tr><td>Il volume dell\u2019extra-colonna \u00e8 troppo elevato<\/td><td>Utilizzare un tubo pi\u00f9 corto con diametro interno inferiore.Utilizzare raccordi ZDV.<\/td><\/tr><tr><td>Bassa temperatura della colonna<\/td><td>Aumentare la temperatura.<\/td><\/tr><tr><td>Fine della durata della precolonna o della colonna analitica<\/td><td>Sostituire la precolonna e\/o la colonna.<\/td><\/tr><tr><td>Efficienza della colonna insufficiente<\/td><td>Provare a utilizzare una colonna con particelle pi\u00f9 piccole.<\/td><\/tr><tr><td>Coeluizione<\/td><td>La perdita di risoluzione pu\u00f2 essere causata dalla degradazione della fase mobile o dalla contaminazione delle precolonne. Preparare una nuova fase mobile e sostituire la precolonna. Se non si riesce a separare il picco coeluente, ripristinare o&nbsp;sostituire la colonna analitica.L\u2019assenza di risoluzione iniziale durante lo sviluppo del metodo indica l\u2019inadeguatezza della selettivit\u00e0 della colonna o dei parametri cromatografici. Regolare la fase mobile e la temperatura della colonna o provare una colonna con una diversa selettivit\u00e0 della fase stazionaria.<\/td><\/tr><tr><td>Perdita<\/td><td>Verificare l\u2019eventuale presenza di raccordi allentati e, nel caso, effettuarne il serraggio o la sostituzione.Se si riscontrano perdite o precipitati nella pompa, potrebbe essere necessario sostituire le guarnizioni.Come gestire una perdita di sensibilit\u00e0<\/td><\/tr><\/tbody><\/table><\/figure>\n\n\n<div class=\"wp-block-custom-chromatogram-article-top\"><div class=\"chromatogram-article-placeholder\"><div class=\"figure-heading\"><\/div><div class='chromatogram-article-inner-full'><div class=\"chromatogram-article-inner\">\n<style>.kb-image45316_3f450b-22 .kb-image-has-overlay:after{opacity:0.3;}<\/style>\n<div class=\"wp-block-kadence-image kb-image45316_3f450b-22\"><figure class=\"aligncenter size-medium_large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"768\" height=\"915\" src=\"https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/\/figure-article-GNAR3485-02-768x915.jpg\" alt=\"\" class=\"kb-img wp-image-21320\" title=\"-\" srcset=\"https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-02-768x915.jpg 768w, https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-02-252x300.jpg 252w, https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-02-859x1024.jpg 859w, https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-02.jpg 1000w\" sizes=\"auto, (max-width: 768px) 100vw, 768px\" \/><\/figure><\/div>\n\n<\/div><\/div><\/div>\n\n\n<p>Una perdita di sensibilit\u00e0 pu\u00f2 essere indice di problemi legati alla preparazione del campione o al sistema analitico. Innanzitutto bisogna accertarsi che la procedura di preparazione del campione sia stata eseguita correttamente, anche relativamente al tempo e alla temperatura di stoccaggio, come pure verificare che i parametri del sistema siano impostati correttamente e funzionino nel modo giusto. Prima di ricercare cause pi\u00f9 complesse, verificare sempre se vi sono problemi evidenti (per esempio: errori di calcolo\/diluizione, ago dell\u2019autocampionatore non inserito nel campione, volume di iniezione sbagliato, impostazioni del rilevatore errate, assenza di flusso della fase mobile, rilevatore o lampada spenti, integrit\u00e0 dello standard di riferimento, ecc.). Un ulteriore controllo del lavoro da parte di un collega pu\u00f2 rappresentare un aiuto preziosissimo, perch\u00e9 spesso \u00e8 pi\u00f9 facile per una persona esterna individuare i problemi rispetto a chi \u00e8 coinvolto nell\u2019attivit\u00e0.<\/p>\n\n\n\n<p>Una volta esclusi i problemi pi\u00f9 banali, l\u2019analisi di uno standard noto \u00e8 uno strumento diagnostico utile per la risoluzione dei problemi LC. Se i risultati rientrano nell\u2019intervallo previsto significa che il sistema funziona correttamente e che il problema risiede nella preparazione o manipolazione del campione. Se invece si registra una bassa risposta anche relativamente allo standard, \u00e8 probabile che l\u2019origine del problema sia lo strumento. \u00c8 inoltre possibile che gli analiti siano semplicemente al di fuori dell\u2019intervallo di sensibilit\u00e0 dello strumento. In tal caso \u00e8 possibile farli rientrare nell\u2019intervallo regolando la concentrazione del campione, ma occorre fare attenzione a non provocare la perdita degli analiti pi\u00f9 volatili.<\/p>\n\n\n\n<p>Se una bassa risposta si verifica solo con le prime iniezioni, \u00e8 possibile che il campione sia adsorbente nei siti attivi del loop di campionamento o della colonna. L\u2019utilizzo di una soluzione passivante o l\u2019effettuazione di alcune iniezioni di campione preliminari per condizionare il sistema e ridurre l\u2019adsorbimento prima dell\u2019analisi effettiva del campione pu\u00f2 contribuire a ripristinare la risposta degli analiti. L\u2019eventuale diminuzione della risposta in tutti i picchi \u00e8 probabilmente causata da errori di calcolo, diluizioni sbagliate o da una riduzione del volume di iniezione dovuta a perdite, malfunzionamenti del sistema, errori di programmazione o utilizzo di un loop di campionamento di dimensioni sbagliate. Se si osserva una perdita di ritenzione molto ingente \u00e8 possibile che si sia verificata la disidratazione della fase e che si debba rigenerare o sostituire la colonna; tuttavia \u00e8 un evento relativamente raro rispetto ad altre cause.<\/p>\n\n\n\n<p>Nel caso dell\u2019analisi LC-MS, la perdita di sensibilit\u00e0 potrebbe essere causata da altri fattori, come problemi relativi all\u2019analizzatore MS, quindi \u00e8 fondamentale verificarne il perfetto funzionamento. L\u2019iniezione diretta della soluzione di tuning nel MS (bypassando il sistema LC) rappresenta una procedura semplice che fornisce informazioni utili per la risoluzione dei problemi. Dato che la perdita di sensibilit\u00e0 del MS pu\u00f2 dipendere da diverse cause (per esempio: pulizia dell\u2019ottica, tampone precipitato nell\u2019entrata del MS, necessit\u00e0 di cambiare un moltiplicatore di elettroni, prestazione della sorgente di ionizzazione, tuning dei composti, ecc.), consigliamo di contattare il produttore per avere informazioni specifiche sulla risoluzione dei problemi. La soppressione ionica dovuta alle interferenze della matrice pu\u00f2 inoltre causare una scarsa risposta nei sistemi LC-MS, ma per tale problematica sono solitamente necessarie modifiche di metodo rilevanti che possono richiedere una nuova validazione, quali migliori procedure di preparazione del campione, utilizzo di standard interni o accoppiati alla matrice, come pure variazioni della composizione della fase mobile.<\/p>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading\">Stabilizzazione dei tempi di ritenzione variabili<\/h2>\n\n\n<div class=\"wp-block-custom-chromatogram-article-top\"><div class=\"chromatogram-article-placeholder\"><div class=\"figure-heading\"><\/div><div class='chromatogram-article-inner-full'><div class=\"chromatogram-article-inner\">\n<style>.kb-image45316_0008c4-bc .kb-image-has-overlay:after{opacity:0.3;}<\/style>\n<div class=\"wp-block-kadence-image kb-image45316_0008c4-bc\"><figure class=\"aligncenter size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"1024\" height=\"512\" src=\"https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/\/figure-article-GNAR3485-03-1024x512.jpg\" alt=\"\" class=\"kb-img wp-image-21326\" title=\"-\" srcset=\"https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-03-1024x512.jpg 1024w, https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-03-300x150.jpg 300w, https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-03-768x384.jpg 768w, https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-03-1536x768.jpg 1536w, https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-03.jpg 1800w\" sizes=\"auto, (max-width: 1024px) 100vw, 1024px\" \/><\/figure><\/div>\n\n<\/div><\/div><\/div>\n\n\n<p>Per un\u2019accurata identificazione e quantificazione \u00e8 fondamentale che gli analiti eluiscano sempre nello stesso tempo di ritenzione. Tuttavia non \u00e8 insolito osservare variazioni dei tempi di ritenzione durante le analisi ordinarie, e le cause possono essere molteplici. Come primo passo nel troubleshooting LC occorre verificare che tutte le impostazioni del metodo siano corrette e che la fase mobile sia stata preparata correttamente (soprattutto se si nota un cambiamento rilevante anzich\u00e9 una leggera variazione). La preparazione di una nuova fase mobile rappresenta una soluzione semplice per eliminare i problemi dovuti a una modifica della composizione in seguito a evaporazione, reazioni, contaminazione o miscelazione incompleta. Inoltre, se si trasferisce un metodo esistente in un nuovo strumento non bisogna trascurare le possibili differenze di volume morto tra gli strumenti, in quanto possono influenzare significativamente il tempo di ritenzione. Altre possibili cause sono le seguenti:<\/p>\n\n\n\n<ol class=\"wp-block-list\">\n<li>Velocit\u00e0 di flusso sbagliata o variabile: confermare manualmente la correttezza della velocit\u00e0 di flusso e verificare l\u2019assenza di perdite nel sistema.<\/li>\n\n\n\n<li>Fluttuazioni di temperatura: utilizzare sempre un comparto colonne termostatato.<\/li>\n\n\n\n<li>Mancata corrispondenza tra solventi: assicurarsi che il solvente del campione sia compatibile con la fase mobile iniziale (cercare di far corrispondere sia il rapporto tra la componente acquosa e quella organica sia la forza del tampone.).<\/li>\n\n\n\n<li>Sovraccarico di campione: non iniettare una quantit\u00e0 di campione superiore alla capacit\u00e0 della colonna.<\/li>\n\n\n\n<li>Contaminazione\/ostruzione della colonna: sciacquare la colonna per rimuovere l\u2019eventuale particolato, soprattutto in caso di sovrapressione elevata. Se questa procedura non funziona, forse \u00e8 il momento di sostituire la colonna. Si raccomanda di utilizzare una precolonna per minimizzare la contaminazione e massimizzare la durata della colonna.<\/li>\n\n\n\n<li>Interferenze della matrice: analizzare uno standard di solvente e confrontarlo con il campione per vedere se i picchi non costanti sono effettivamente componenti della matrice.<\/li>\n\n\n\n<li>Equilibratura della colonna insufficiente: aumentare l\u2019intervallo di tempo tra le corse; si raccomanda un tempo sufficiente per il passaggio di 10 volumi di colonna. Nota: L\u2019equilibratura della colonna potrebbe richiedere pi\u00f9 tempo nelle analisi HILIC.<\/li>\n\n\n\n<li>Bolle d\u2019aria: spurgare l\u2019aria dalla pompa e accertarsi che la fase mobile sia degassata. Controllare le guarnizioni della pompa e sostituirle in caso di perdite evidenti.<\/li>\n<\/ol>\n\n\n\n<p>Ogni tanto, durante l\u2019analisi possono apparire improvvisamente picchi fantasma. Questo fenomeno pu\u00f2 essere verificato effettuando un\u2019iniezione di solvente dopo un\u2019iniezione di campione. Se compare un picco, si tratter\u00e0 probabilmente di un picco a eluizione tardiva derivante dalla precedente iniezione di campione. In questo caso, il problema del carryover potrebbe essere eliminato aumentando la velocit\u00e0 di flusso, prolungando il tempo della corsa o aggiungendo una fase con gradiente. \u00c8 possibile ridurre il rischio di carryover anche minimizzando il volume extra-sistema realizzando il collegamento idraulico dell\u2019LC con tubi pi\u00f9 corti e di diametro inferiore e connessioni ZDV in modo da ridurre i punti in cui il campione pu\u00f2 accumularsi. Inoltre, per ridurre il carryover \u00e8 importante tenere conto dei solventi e dei parametri di lavaggio dell\u2019ago. I picchi fantasma possono essere causati anche dalla contaminazione della fase mobile, della precolonna o della colonna analitica. Questo problema pu\u00f2 essere risolto preparando una fase mobile nuova e degassata, e sostituendo la precolonna e la colonna analitica (dopo averla risciacquata secondo la procedura di pulizia raccomandata dal produttore).<\/p>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading\">Ripristino della normale pressione di sistema<\/h2>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading\">Diagnosticare la causa dell\u2019aumento della contropressione<\/h3>\n\n\n\n<p>L\u2019aumento della contropressione \u00e8 uno dei problemi pi\u00f9 comuni nel troubleshooting LC, ma \u00e8 importante ricordare che non tutti i cambiamenti di pressione indicano che qualcosa non va. Per esempio, durante le analisi di gradiente la pressione cambia con l\u2019aumentare della viscosit\u00e0 della fase mobile (viscosit\u00e0 massima: ~50:50 per metanolo:acqua e ~20:80 per acetonitrile:acqua). Pertanto per diagnosticare un problema \u00e8 importante conoscere le condizioni di impostazione normali. \u00c8 inoltre fondamentale operare entro i limiti di pressione dell\u2019LC (per esempio, non utilizzare colonne &lt;2,7 \u00b5m in strumenti con un limite di 400 bar). La presenza di una contropressione eccessivamente alta \u00e8 indice di un\u2019ostruzione nel sistema, e per risolvere il problema bisogna innanzitutto identificarne la posizione isolando le fonti potenziali una alla volta secondo la procedura indicata nella Figura 2.<\/p>\n\n\n<div class=\"wp-block-custom-chromatogram-article-top\"><div class=\"chromatogram-article-placeholder\"><div class=\"figure-heading\"><strong>Figura 2:<\/strong>\u00a0Fasi del troubleshooting LC per localizzare le ostruzioni del sistema che provocano un aumento della contropressione.<\/div><div class='chromatogram-article-inner-full'><div class=\"chromatogram-article-inner\">\n<style>.kb-image45316_00f6b4-3e .kb-image-has-overlay:after{opacity:0.3;}<\/style>\n<div class=\"wp-block-kadence-image kb-image45316_00f6b4-3e\"><figure class=\"aligncenter size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"1024\" height=\"437\" src=\"https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/\/figure-article-GNAR3485-04-1024x437.jpg\" alt=\"\" class=\"kb-img wp-image-21332\" title=\"-\" srcset=\"https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-04-1024x437.jpg 1024w, https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-04-300x128.jpg 300w, https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-04-768x328.jpg 768w, https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-04-1536x655.jpg 1536w, https:\/\/discover.restek.com\/wp-content\/uploads\/figure-article-GNAR3485-04.jpg 1800w\" sizes=\"auto, (max-width: 1024px) 100vw, 1024px\" \/><\/figure><\/div>\n\n<\/div><\/div><\/div>\n\n\n<div style=\"height:20px\" aria-hidden=\"true\" class=\"wp-block-spacer\"><\/div>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading\">Rimozione di ostruzioni e contaminanti della colonna<\/h3>\n\n\n\n<p>Un aumento della contropressione e una riduzione delle prestazioni cromatografiche possono indicare una contaminazione o un\u2019ostruzione della colonna. Il risciacquo della colonna e la prevenzione di possibili ostruzioni future seguendo le linee guida indicate di seguito pu\u00f2 risolvere il problema ed estendere la durata della colonna analitica.<\/p>\n\n\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\">Trattamento<\/h4>\n\n\n\n<p>Sciacquare con una serie di solventi le colonne HPLC e UHPLC nella direzione indicata sulla colonna pu\u00f2 essere un metodo efficace per rimuovere il particolato e i contaminanti chimici che hanno provocato le ostruzioni. Utilizzare un minimo di 20 volumi di colonna di ciascun solvente e sciacquare nell\u2019ordine indicato nella Tabella II riportata di seguito. Dopo la rigenerazione, conservare sempre la colonna nel solvente consigliato dal produttore.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Tabella II:<\/strong>&nbsp;Sequenza di solventi per il risciacquo della colonna<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-table\"><table class=\"has-fixed-layout\"><tbody><tr><td><strong>Colonne a fase inversa<\/strong><\/td><td><strong>Colonne a fase normale<\/strong><\/td><\/tr><tr><td>1.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Water:methanol (95:5 v\/v)<\/td><td>1. Isopropyl alcohol<\/td><\/tr><tr><td>2.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Methanol<\/td><td>2.&nbsp;<em>n<\/em>-Hexane<\/td><\/tr><tr><td>3.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Isopropyl alcohol<\/td><td>3. Ethanol<\/td><\/tr><tr><td>4.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<em>n<\/em>-Hexane<\/td><td>4. Original mobile phase<\/td><\/tr><tr><td>5.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Isopropyl alcohol<\/td><td>&nbsp;<\/td><\/tr><tr><td>6.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Methanol<\/td><td>&nbsp;<\/td><\/tr><tr><td>7.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Water:methanol (95:5 v\/v)<\/td><td>&nbsp;<\/td><\/tr><tr><td>8.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Original mobile phase<\/td><td>&nbsp;<\/td><\/tr><\/tbody><\/table><\/figure>\n\n\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\">Prevenzione<\/h4>\n\n\n\n<ul class=\"wp-block-list\">\n<li>Usare sempre fasi mobili nuove e filtrate per rimuovere il particolato e impedire una proliferazione batterica. Tenere chiusi i flaconi della fase mobile per evitare contaminazioni. In caso di utilizzo di analizzatori MS, assicurarsi di utilizzare solventi e additivi di grado LC-MS.<\/li>\n\n\n\n<li>Filtrare i campioni per rimuovere il particolato della matrice; l\u2019uso di filtri siringa e vial filtranti facilita la procedura.<\/li>\n\n\n\n<li>Assicurarsi che il solvente del campione e le fasi mobili siano compatibili. La mancata corrispondenza tra i solventi pu\u00f2 causare la precipitazione di componenti del campione o di sali tampone con conseguenti ostruzioni.<\/li>\n\n\n\n<li>Utilizzare una precolonna o un filtro precolonna per proteggere la colonna analitica. Scegliere sempre un sistema di precolonne e una fase corrispondenti alla colonna analitica.<\/li>\n\n\n\n<li>Ispezionare regolarmente le guarnizioni della pompa, i rotori dell\u2019iniettore automatico, i filtri in linea e i supporti dell\u2019ago, e sostituirli prima che la normale usura ne causi la rottura con conseguente dispersione di particelle nel flusso.<\/li>\n<\/ul>\n\n\n\n<p>Sebbene meno frequentemente, talvolta pu\u00f2 accadere di rilevare pressioni troppo basse, che solitamente sono causate da perdite, quindi \u00e8 necessario controllare accuratamente i raccordi e la pompa per individuare eventuali segni di umidit\u00e0 o precipitati. Se nonostante il serraggio o la sostituzione dei raccordi non \u00e8 possibile risolvere il problema, potrebbe essere giunto il momento di sostituire le guarnizioni della pompa. Il calo di pressione pu\u00f2 essere provocato anche dall\u2019intrappolamento di bolle d\u2019aria o dal blocco di una valvola di ritegno, ma \u00e8 generalmente possibile risolvere entrambi gli inconvenienti risciacquando il sistema con una fase mobile degassata o un solvente idoneo, come l\u2019alcol isopropilico. Se questa procedura non risolve il problema, forse \u00e8 il momento di sostituire le valvole di ritegno. Alcune perdite potrebbero essere dovute a graffi sulla guarnizione del rotore nelle valvole a sei porte. La perdita potrebbe non essere visibile, ma causer\u00e0 una riduzione della pressione e del flusso. Quando si ricercano perdite o si misura la precisione della velocit\u00e0 di flusso, assicurarsi di utilizzare una colonna vecchia o un restrittore di flusso. Oltre a cali di pressione, le perdite possono causare anche altri problemi cromatografici, quali una maggiore ritenzione, una riduzione del segnale o addirittura un blocco dello strumento automatico. Per prevenire questi problemi, controllare quotidianamente i raccordi per accertare l\u2019assenza di residui e pulire i tubi con una velina da laboratorio per eliminare qualsiasi traccia di umidit\u00e0. Riserrare delicatamente i raccordi e sostituire regolarmente tubi, raccordi e guarnizioni nell\u2019ambito di un programma di manutenzione ordinaria rappresenta una buona prassi per prevenire perdite ingenti e conseguenti tempi di inattivit\u00e0. La&nbsp;guida alla manutenzione ordinaria LC&nbsp;di Restek \u00e8 un utile punto di partenza per lo sviluppo o il perfezionamento di un programma di manutenzione.<\/p>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading\">Riepilogo<\/h2>\n\n\n\n<p>Il troubleshooting LC \u00e8 fondamentale per la produzione di dati accurati e affidabili. Sebbene le cause potenziali di scarse prestazioni siano molteplici, osservando attentamente i segnali cromatografici, analizzando singolarmente tutte le possibili cause e facendo un confronto con le condizioni \u201cnormali\u201d \u00e8 possibile individuare velocemente ed efficacemente la causa principale. Infine, trasferendo tutto quanto appreso in un programma di manutenzione ordinaria \u00e8 possibile prevenire problemi futuri e garantire una maggiore efficienza dello strumento.<\/p>\n\n\n\n<div style=\"height:100px\" aria-hidden=\"true\" class=\"wp-block-spacer\"><\/div>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Attieniti a queste linee guida generali unitamente ai manuali delle attrezzature e alle procedure operative standard del tuo laboratorio per rimettere in funzione il tuo strumento in modo veloce ed 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