Key Highlights
- 飲料水中ビスフェノール類のベースライン分離と正確な定量を実現する、迅速かつ簡便なダイレクトインジェクションメソッドを2種類開発
- EU指令の感度要件（LLOQ：2.5 µg/L）を満たす、ビスフェノールA・B・S（BPA、BPB、BPS）をターゲットとした測定メソッド
- 規制変更を見据えて分析対象リストの拡充を検討しているラボに対応した、15種類のビスフェノールの包括的メソッド
要約：飲料水中ビスフェノール類の高感度・高速分析
ビスフェノール類はポリカーボネートプラスチックやエポキシ樹脂の製造に広く使用される合成化学物質であり、環境汚染物質として広く分布しています。エストロゲンと類似した構造を持つため、内分泌かく乱物質として作用し、飲料水中での検出が懸念されています。BPAフリー製品に代替物質として使用されるBPSやBPBも、健康リスクをもたらす可能性が指摘されています。そこで本研究では、EU規制に適合したBPA、BPB、BPSの高速かつ信頼性の高い測定メソッドを開発しました。また、15種類のビスフェノール化合物をターゲットとした包括的メソッドを開発し、飲料水の汚染検査を幅広く実施するラボに対して実用的なアプローチを提供します。
はじめに：EU飲料水指令対応｜飲料水中BPA、BPB、BPSのLC-MS/MS分析
ビスフェノール類は食品や環境中に汚染物質として検出される合成化学物質です。主にポリカーボネートプラスチックやエポキシ樹脂の製造に使用されており、世界的な製造・使用の広がりから、環境や飲料水への混入が懸念されています。2011年にNational Institutes of Health（NIH）が発表した研究では、対象者427名のうち91%の尿サンプルからビスフェノールAが検出されています [1]。ビスフェノール類は2つのフェノール基が架橋基によって結合した共通構造を持ち、エストロゲンと類似したこの構造により、ホルモン機能を模倣・影響し、内分泌かく乱物質に分類されます [2]。ビスフェノールA、B、S人体への影響が指摘されている化合物であり、特にビスフェノールA（BPA）に対しては、食品接触材料や子ども向け玩具における使用規制・禁止に向けた動きが各国規制当局で進んでいます。
一部の地域では規制が整備されているものの、ビスフェノール類およびその誘導体は多種多様な製品に大量に使用されており、環境経路を通じて供給される水への混入リスクが高い状況にあります。ビスフェノールS（BPS）は「BPAフリー」製品においてBPAの代替物質として使用されていますが、健康上の懸念も報告されており、カリフォルニア州Proposition 65では生殖毒性物質に指定されています [3]。ビスフェノールB（BPB）はBPAおよびBPSの代替物質として消費財に使用されていますが、同様に内分泌かく乱作用が懸念されています [4]。欧州連合（EU）の飲料水指令では2026年1月までに、飲料水中のビスフェノールA濃度を基準値2.5 µg/L以下に管理することが水道事業者に義務付けられています [5]。
本研究では、飲料水中ビスフェノール類のダイレクトインジェクションLC-MS/MSメソッドを2種類開発しました。最も分析頻度の高いビスフェノールA、B、Sをターゲットとした高速で信頼性の高いメソッドは、EU飲料水指令に適合しており、添加水サンプルを用いた精度および再現性の評価も実施済みです。また、今後の規制変更を見据えた先行的な対応として、15種類のビスフェノール化合物の包括的メソッドも開発しました。本メソッドは、汚染検査の導入・拡充を検討しているラボにとって、飲料水中のビスフェノール分析における高速かつ簡便な手法となります。
実験
ビスフェノールA、B、SをターゲットとしたLC-MS/MSメソッド
分析条件をTable Iに、ビスフェノールA、B、Sと内部標準のMSトランジションをTable IIに示します。
Table I: ビスフェノールA、B、Sの分析条件
| カラム | Raptor Biphenyl 50 x 3.0 mm, 2.7 μm (cat.# 9309A5E) | ||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ガードカラム | Raptor Biphenyl EXP guard column cartridge 5 x 3.0 mm, 2.7 μm (cat.# 9309A0253) | ||||||||||||
| カラム温度 | 30 °C | ||||||||||||
| 注入量 | 10 μL | ||||||||||||
| 移動相 A | 水 | ||||||||||||
| 移動相 B | メタノール | ||||||||||||
| 流量 | 0.8 mL/min | ||||||||||||
| 検出器 | ESI (-) MS/MS | ||||||||||||
| グラジエント |
|
||||||||||||
| 廃液切替 | 0.00 min | ||||||||||||
| MS切替 | 0.80 min | ||||||||||||
| 廃液切替 | 3.51 min |
Table II: 水サンプル中ビスフェノールA、B、SのMSトランジション
| 分析対象成分 | プレカーサ | プロダクト 1 | プロダクト 2 | 内部標準 |
|---|---|---|---|---|
| Bisphenol S | 249.00 | 108.15 | 92.10 | 1 |
| Bisphenol A | 227.00 | 212.05 | 133.25 | 2 |
| Bisphenol B | 241.00 | 212.05 | 211.10 | 2 |
| Bisphenol A-d16 | 241.00 | 223.25 | – | 2 |
| Bisphenol S-d8 | 257.00 | 112.20 | – | 1 |
15種類ビスフェノールの包括的LC-MS/MSメソッド
分析条件をTable IIIに、15種類のビスフェノールと内部標準のMSトランジションをTable IVに示します。
Table III: 15種類ビスフェノールの分析条件
| カラム | Raptor Biphenyl 50 x 3.0 mm, 2.7 μm (cat.# 9309A5E) | ||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ガードカラム | Raptor Biphenyl EXP guard column cartridge 5 x 3.0 mm, 2.7 μm (cat.# 9309A0253) | ||||||||||||||
| カラム温度 | 30 °C | ||||||||||||||
| 注入量 | 10 μL | ||||||||||||||
| 移動相 A | 水 | ||||||||||||||
| 移動相 B | メタノール | ||||||||||||||
| 流量 | 0.8 mL/min | ||||||||||||||
| 検出器 | ESI (-) MS/MS | ||||||||||||||
| グラジエント |
|
||||||||||||||
| 廃液切替 | 0.00 min | ||||||||||||||
| MS切替 | 1.00 min | ||||||||||||||
| 廃液切替 | 7.00 min |
Table IV: 水サンプル中15種類ビスフェノールのMSトランジション
| 分析対象成分 | プレカーサ | プロダクト 1 | プロダクト 2 | 内部標準 |
|---|---|---|---|---|
| Bisphenol S-d8 | 257.00 | 112.20 | – | 1 |
| Bisphenol S | 249.00 | 108.15 | 92.10 | 1 |
| Bisphenol F | 199.00 | 93.10 | 104.85 | 2 |
| Bisphenol E | 213.00 | 197.10 | 119.05 | 2 |
| Bisphenol A-d16 | 241.00 | 223.25 | – | 2 |
| Bisphenol A | 227.00 | 212.05 | 133.25 | 2 |
| Bisphenol AF | 335.00 | 265.05 | 177.20 | 3 |
| Bisphenol B | 241.00 | 212.05 | 211.10 | 2 |
| Bisphenol C | 255.00 | 240.15 | 147.20 | 2 |
| Bisphenol AP | 289.00 | 274.15 | 273.15 | 2 |
| Bisphenol Z | 267.00 | 173.15 | 223.10 | 2 |
| Bisphenol G | 311.00 | 296.30 | 295.00 | 3 |
| Bisphenol FL | 349.00 | 256.15 | 215.20 | 2 |
| Bisphenol BP | 351.00 | 274.15 | 273.15 | 3 |
| Bisphenol M | 345.00 | 251.20 | 330.20 | 3 |
| Bisphenol P-13C4 | 349.00 | 333.20 | – | 3 |
| Bisphenol P | 345.00 | 330.15 | 315.15 | 3 |
| Bisphenol PH | 379.00 | 364.10 | 209.15 | 3 |
標準試料およびサンプルの前処理
ビスフェノール類LC-MS/MSメソッドの校正用標準溶液は、2.5〜300 µg/Lの濃度範囲で以下の手順にて調製しました。
- 1 mg/Lの同位体標識された内部標準（IS）30 µLを作業用中間標準溶液 50 µLおよびMSグレード水 920 µLと混合し、褐色バイアル（cat.# 21142）に添加
- 5種類の飲料水を現地で採取し、精度および再現性の評価には、1 mLの水サンプルに2.5（LLOQ）、7.5（LQC）、75（MQC）µg/Lの濃度で添加し調製
- 全てのサンプルをキャップして短時間のボルテックス後、10 µLをLC-MS/MSに注入して分析
結果と考察
クロマトグラフィー性能
本研究で確立した分析条件のもと、Raptor Biphenylカラムは、BPA・BPB・BPSをターゲットとしたメソッドおよび15種類ビスフェノールの包括的メソッドのいずれにおいても、全化合物のベースライン分離を達成しました。分析対象物質が他の成分からベースライン分離されているため、MSに到達する時点では分析対象物質だけが溶出していることになります。したがって、他の成分によるイオンサプレッションが起きにくくなり、正確な定量が可能です。また、各分析対象を正確に積分するためにベースライン分離を必要とする、より安価で選択性の低い蛍光検出器への適用も可能にします。2種類のLC-MS/MSメソッドはいずれもダイレクトインジェクションを採用しており、短い分析時間で高スループットが求められる分析に適しています。総サイクル時間は、ビスフェノール3成分をターゲットとしたメソッドではわずか5分、15成分対象の包括的メソッドでは8.5分です。マトリックス効果の低減およびMSへのマトリックス流入量の削減を目的として、化合物溶出の前後にダイバーターバルブを使用し、溶出液を廃液に切り替えました。この操作により、メンテナンスまでの分析可能サンプル数が増加し、装置のダウンタイムを低減できます。
マトリックス効果の補正｜内部標準の最適化で15種類のビスフェノールを正確に定量
ビスフェノールA、B、Sの分析において、マトリックス効果を補正する2種類の同位体標識された内部標準の使用を検討、評価しました。評価の結果、BPA・BPB ・BPSの3成分メソッドでは良好な精度および再現性が得られました。しかし、この2種類の内部標準を15種類のビスフェノールを対象とした包括的メソッドに適用したところ、中盤から後半にかけて溶出する成分の定量結果が許容範囲を外れることが判明しました。バルブ切替の最適化によりビスフェノールFおよびEの精度と再現性は改善されましたが、ビスフェノールAF、G、BP、M、P、PHの定量結果は改善されませんでした。3種目の内部標準としてビスフェノールP-13C4を導入した結果、15種類全てのビスフェノールで良好な再現性および精度が得られました。
直線性
2種類のビスフェノールLC-MS/MSメソッドはいずれも直線的な検量線を示しました。直線回帰（1/x重み付け）を用いて定量した結果、ビスフェノールA、B、Sは2.5〜300 µg/Lの検量範囲においてr²値0.993以上、偏差20%未満と良好な直線性を示しました。包括的メソッドも直線回帰（1/x重み付け）を用いて定量し、ビスフェノールPH（5〜150 µg/L）、ビスフェノールG（5〜100 µg/L）、ビスフェノールAF（2.5〜150 µg/L）を除く全化合物で、2.5〜300 µg/Lの検量範囲においてr²値0.991以上、偏差20%未満に収まり、十分な精度が得られました。
精度および再現性
現地で採取した飲料水に、ビスフェノールA、B、Sを2.5（LLOQ）、7.5（LQC）、75（MQC）µg/Lで添加し、3日間にわたって各3バッチ、計9回の分析を行いました。結果をTable Vに示します。日内精度（回収率）はビスフェノールA、B、Sで82.4〜113.7%、日間回収率は86.6〜108.3%の範囲でした。再現性（%RSD）は日内で≤11.2%、日間で≤6.6%でした。
Table V: ビスフェノールA、B、Sをターゲットとしたメソッドの精度および再現性
| Bisphenol S | ||||||||||||
| 水サンプル | 目標濃度 (μg/L) |
Day 1 | Day 2 | Day 3 | 日間 | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 計算濃度 (μg/L) |
% Recovery |
%RSD | 計算濃度 (μg/L) |
% Recovery |
%RSD | 計算濃度 (μg/L) |
% Recovery |
%RSD | Average | %RSD | ||
| 1 飲料水 | 2.5 | 2.2 | 86.8 | 4.0 | 2.3 | 90.6 | 2.2 | 2.4 | 95.7 | 1.2 | 91.0 | 4.9 |
| 7.5 | 7.9 | 106.0 | 2.5 | 7.8 | 103.8 | 3.6 | 7.9 | 105.2 | 1.5 | 105.0 | 1.1 | |
| 75.0 | 78.0 | 103.9 | 0.9 | 75.5 | 100.7 | 4.1 | 76.8 | 102.4 | 1.5 | 102.3 | 1.6 | |
| 2 製氷機水 | 2.5 | 2.1 | 84.8 | 2.9 | 2.3 | 91.2 | 4.3 | 2.4 | 95.0 | 2.9 | 90.3 | 5.7 |
| 7.5 | 7.6 | 101.3 | 5.8 | 7.9 | 104.7 | 2.9 | 7.8 | 104.2 | 1.8 | 103.4 | 1.8 | |
| 75.0 | 77.6 | 103.5 | 5.7 | 78.7 | 104.9 | 3.3 | 75.7 | 100.9 | 1.9 | 103.1 | 2.0 | |
| 3 飲料水 | 2.5 | 2.1 | 84.0 | 3.0 | 2.3 | 91.1 | 5.4 | 2.4 | 95.8 | 1.6 | 90.3 | 6.6 |
| 7.5 | 7.7 | 102.4 | 7.4 | 7.9 | 105.5 | 4.7 | 7.9 | 105.1 | 1.2 | 104.3 | 1.6 | |
| 75.0 | 80.5 | 107.3 | 2.8 | 80.7 | 107.6 | 5.2 | 77.0 | 102.6 | 1.3 | 105.9 | 2.6 | |
| 4 飲料水 | 2.5 | 2.1 | 84.6 | 7.6 | 2.2 | 86.3 | 4.5 | 2.2 | 88.9 | 2.6 | 86.6 | 2.5 |
| 7.5 | 7.6 | 101.1 | 2.6 | 7.3 | 97.1 | 4.4 | 7.4 | 98.0 | 6.4 | 98.7 | 2.1 | |
| 75.0 | 78.0 | 103.9 | 2.2 | 78.1 | 104.1 | 1.9 | 78.0 | 104.0 | 2.0 | 104.0 | 0.1 | |
| 5 飲料水 | 2.5 | 2.1 | 82.4 | 4.4 | 2.3 | 92.6 | 5.3 | 2.3 | 91.5 | 2.4 | 88.8 | 6.3 |
| 7.5 | 7.6 | 101.4 | 4.8 | 8.1 | 108.2 | 2.8 | 7.6 | 101.5 | 2.3 | 103.7 | 3.8 | |
| 75.0 | 77.8 | 103.7 | 2.0 | 85.3 | 113.7 | 3.9 | 76.1 | 101.5 | 1.9 | 106.3 | 6.1 | |
| Bisphenol B | ||||||||||||
| 水サンプル | 目標濃度 (μg/L) |
Day 1 | Day 2 | Day 3 | 日間 | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 計算濃度 (μg/L) |
% Recovery |
%RSD | 計算濃度 (μg/L) |
% Recovery |
%RSD | 計算濃度 (μg/L) |
% Recovery |
%RSD | Average | %RSD | ||
| 1 飲料水 | 2.5 | 2.7 | 106.3 | 2.6 | 2.7 | 106.6 | 6.5 | 2.6 | 102.4 | 4.7 | 105.1 | 2.2 |
| 7.5 | 7.3 | 97.0 | 2.1 | 7.3 | 97.8 | 2.9 | 7.0 | 92.8 | 4.1 | 95.9 | 2.8 | |
| 75.0 | 72.0 | 96.0 | 6.6 | 69.6 | 92.8 | 3.4 | 74.4 | 99.2 | 11.2 | 96.0 | 3.3 | |
| 2 製氷機水 | 2.5 | 2.5 | 100.1 | 5.4 | 2.4 | 96.3 | 4.7 | 2.5 | 101.4 | 1.7 | 99.3 | 2.7 |
| 7.5 | 7.2 | 95.5 | 2.3 | 7.0 | 93.2 | 5.3 | 7.1 | 94.4 | 10.6 | 94.4 | 1.3 | |
| 75.0 | 69.5 | 92.7 | 2.2 | 65.7 | 87.6 | 1.8 | 70.2 | 93.7 | 5.3 | 91.3 | 3.5 | |
| 3 飲料水 | 2.5 | 2.5 | 101.9 | 3.8 | 2.7 | 108.0 | 0.1 | 2.7 | 106.8 | 3.7 | 105.6 | 3.0 |
| 7.5 | 7.4 | 98.1 | 1.7 | 7.3 | 97.2 | 4.3 | 7.2 | 96.2 | 3.2 | 97.2 | 1.0 | |
| 75.0 | 68.2 | 91.0 | 3.1 | 71.1 | 94.8 | 2.4 | 72.6 | 96.8 | 4.0 | 94.2 | 3.2 | |
| 4 飲料水 | 2.5 | 2.7 | 106.4 | 5.8 | 2.7 | 110.0 | 1.7 | 2.7 | 108.6 | 7.2 | 108.3 | 1.7 |
| 7.5 | 7.8 | 104.2 | 3.1 | 7.7 | 103.0 | 2.3 | 7.5 | 100.4 | 5.6 | 102.5 | 1.9 | |
| 75.0 | 79.6 | 106.1 | 3.0 | 72.7 | 96.9 | 1.7 | 71.6 | 95.5 | 3.4 | 99.5 | 5.8 | |
| 5 飲料水 | 2.5 | 2.7 | 107.7 | 1.7 | 2.6 | 102.4 | 7.2 | 2.5 | 101.7 | 0.2 | 103.9 | 3.1 |
| 7.5 | 7.5 | 100.5 | 2.6 | 7.4 | 99.0 | 2.5 | 6.7 | 89.9 | 6.0 | 96.5 | 6.0 | |
| 75.0 | 71.4 | 95.2 | 2.4 | 70.6 | 94.1 | 1.9 | 66.0 | 88.0 | 1.7 | 92.4 | 4.2 | |
| Bisphenol A | ||||||||||||
| 水サンプル | 目標濃度 (μg/L) |
Day 1 | Day 2 | Day 3 | 日間 | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 計算濃度 (μg/L) |
% Recovery |
%RSD | 計算濃度 (μg/L) |
% Recovery |
%RSD | 計算濃度 (μg/L) |
% Recovery |
%RSD | Average | %RSD | ||
| 1 飲料水 | 2.5 | 2.8 | 110.1 | 7.5 | 2.5 | 101.0 | 8.4 | 2.6 | 105.1 | 2.9 | 105.4 | 4.3 |
| 7.5 | 7.5 | 100.2 | 6.4 | 7.6 | 102.0 | 0.9 | 7.2 | 96.0 | 3.9 | 99.4 | 3.1 | |
| 75.0 | 72.9 | 97.1 | 3.6 | 71.4 | 95.2 | 3.0 | 76.9 | 102.6 | 5.8 | 98.3 | 3.9 | |
| 2 製氷機水 | 2.5 | 2.5 | 99.2 | 4.3 | 2.7 | 107.4 | 8.1 | 2.6 | 103.9 | 9.4 | 103.5 | 4.0 |
| 7.5 | 7.6 | 101.6 | 2.9 | 7.7 | 102.4 | 5.7 | 7.7 | 102.3 | 6.1 | 102.1 | 0.4 | |
| 75.0 | 71.3 | 95.1 | 4.6 | 73.6 | 98.1 | 3.3 | 73.8 | 98.4 | 1.4 | 97.2 | 1.9 | |
| 3 飲料水 | 2.5 | 2.7 | 108.7 | 7.7 | 2.6 | 104.1 | 1.5 | 2.5 | 100.6 | 4.8 | 104.5 | 3.9 |
| 7.5 | 7.8 | 104.0 | 3.6 | 7.4 | 98.2 | 3.6 | 7.4 | 98.7 | 3.1 | 100.3 | 3.2 | |
| 75.0 | 72.6 | 96.8 | 2.9 | 75.5 | 100.6 | 4.1 | 76.5 | 102.0 | 3.3 | 99.8 | 2.7 | |
| 4 飲料水 | 2.5 | 2.6 | 102.7 | 5.4 | 2.5 | 101.3 | 3.2 | 2.6 | 106.0 | 8.9 | 103.3 | 2.3 |
| 7.5 | 8.0 | 107.0 | 3.4 | 7.6 | 100.7 | 3.5 | 7.6 | 101.8 | 5.3 | 103.2 | 3.3 | |
| 75.0 | 75.3 | 100.4 | 3.1 | 75.0 | 100.0 | 2.8 | 73.4 | 97.8 | 5.4 | 99.4 | 1.4 | |
| 5 飲料水 | 2.5 | 2.5 | 100.5 | 6.2 | 2.7 | 107.3 | 3.1 | 2.5 | 99.4 | 3.2 | 102.4 | 4.2 |
| 7.5 | 7.7 | 102.2 | 6.1 | 7.4 | 98.4 | 2.5 | 7.1 | 94.4 | 7.7 | 98.4 | 4.0 | |
| 75.0 | 73.3 | 97.7 | 2.1 | 73.7 | 98.3 | 0.2 | 71.3 | 95.1 | 3.9 | 97.0 | 1.8 | |
包括的メソッドについても同様に、15種類のビスフェノールを2.5、7.5、75.0 µg/Lの濃度となるように添加した現地採取飲料水を用い、3日間・計9回の分析でバリデーションを実施しました。それぞれの結果はFigure 3、4、5に示しましたが、日間回収率は88.9〜115.9%、再現性（%RSD）は≤17.3%（n=9）でした。
まとめ：EU飲料水指令対応｜飲料水中ビスフェノール類LC-MS/MS分析メソッドの開発
本研究では、飲料水中のビスフェノール類分析に対応する2種類の信頼性の高いLC-MS/MSメソッドを開発し、いずれも良好な定量結果を得ました。ダイレクトインジェクションの採用によりサンプル前処理を省略し、全化合物のベースライン分離を維持しながら分析時間の短縮を実現しています。
BPA・BPS・BPBをターゲットとした分析メソッドは3成分の迅速な定量に最適化されており、15種類のビスフェノールに対応した包括的メソッドは今後の規制変更を見据えた対象物質リストの拡充に対応しています。いずれもEU飲料水指令の感度要件を満たしており、ビスフェノール汚染モニタリングの実用的なルーチンメソッドとして適していることが示されました。
参考文献
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