LC-MS/MSによる全血中のカンナビノイド分析は、さまざまな要因により非常に難易度が高く、なかでも報告ガイドラインで求められる極めて低い検出限界を達成することが最大の課題となっています。多くの法医学研究所では、Δ9-テトラヒドロカンナビノール（Δ9-THC）や、11-ヒドロキシ-Δ9-THC（11-OH-Δ9-THC）、11-ノル-9-カルボキシ-Δ9-THC（Δ9-THC-COOH）といった重要な代謝物について、0.5ng/mL以下の定量下限（LOQ）達成を目標としています。しかし、こうした低い検出限界の達成は、特に感度の低い旧型装置では非常に困難です。従来の感度向上策をすべて試してもなお、十分な結果が得られない場合には、イナートLCカラムの導入をぜひご検討ください。
イナートLCカラムの構造は従来のステンレス製LCカラムと同様ですが、表面に不活性コーティングが施されている点で異なります。このコーティングは、金属表面に対する分析対象成分のキレート化や吸着などの非特異的結合を防ぐ役割を持ちます。キレート化が起こるとピーク形状が悪化したり、分析対象成分の損失により検出感度が低下することがあります。すべての化合物が非特異的結合（キレート化）を起こすわけではありませんが、特に酸性化合物はキレート化しやすい傾向があります。
イナートカラムを使用することで、すべての分析対象成分で違いが出るわけではありませんが、検出感度の向上は期待できます。以下の実験では、全血中のカンナビノイド分析にイナートLCカラムと従来のステンレス製カラムを用いて、それぞれの性能を比較しました。開発したメソッドでは、Raptor FluoroPhenyl固定相を利用し、Δ8-THC、Δ9-THCおよびそれらのヒドロキシ・カルボキシ代謝物を分離を実施しました。イナートカラムの有効性を評価するために、分析対象成分を含むサンプルをRaptor Inert FluoroPhenylカラムとRaptor FluoroPhenylカラム（標準カラム）の両方で目的成分を含むサンプルの分析を実行し、その結果を比較しました。
LC_CF0829
Peaks
| Peaks | Conc. (ng/mL) | Precursor | Product 1 | Product 2 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 1. | 11-OH-Δ8-THC | 100 | 331.0 | 313.0 | 201.1 |
| 2. | 11-OH-Δ9-THC | 100 | 331.0 | 313.0 | 201.1 |
| 3. | Δ8-THC-COOH | 500 | 345.1 | 327.0 | 299.2 |
| 4. | Δ9-THC-COOH | 500 | 345.1 | 327.0 | 299.2 |
| 5. | Δ8-THC | 100 | 315.0 | 193.0 | 123.2 |
| 6. | Δ9-THC | 100 | 315.0 | 193.0 | 123.2 |
Conditions
| Column | See notes. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Dimensions: | 100 mm x 3 mm ID | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Particle Size: | 2.7 µm | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pore Size: | 90 Å | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Temp.: | 40 °C | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Standard/Sample | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Δ8-Tetrahydrocannabinol (Δ8-THC) (cat.# 34090) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Δ9-Tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) (cat.# 34067) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| (±)11-nor-9-carboxy-Δ-9-THC (Δ9-THC-COOH) (cat.# 34068) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Other compounds obtained separately. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Diluent: | 40:60 Water:methanol, both with 0.1% formic acid (v/v) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Inj. Vol.: | 5 µL | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Mobile Phase | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| A: | Water, 0.1% formic acid | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| B: | Methanol, 0.1% formic acid | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Max Pressure: | 390 bar |
| Detector | Shimadzu 8045 MS/MS |
|---|---|
| Ion Mode: | ESI+ |
| Instrument | Shimadzu Nexera X2 |
| Sample Preparation | Five hundred microliters of whole blood was transferred to a 12 mL glass test tube. Fifty microliters of internal standard and 50 µL of control material were transferred to the test tube and vortexed. Five hundred microliters of HPLC grade water was added to each sample and vortexed. One hundred microliters of 10% acetic acid was added to each sample and vortexed. Two and a half milliliters of 80:20 hexanes:ethyl acetate was added to each sample and vortexed until visibly combined. Samples were centrifuged at 2800 rpm for 15 minutes. The top layer was transferred to a new glass test tube and dried down under nitrogen. Samples were reconstituted with 100 µL of 40:60 methanol:water, both containing 0.1% formic acid, and vortexed. Samples were transferred to 2 mL screw-thread vials (cat.# 21143) with glass inserts (cat.# 21776) and capped with short-cap, screw-vial closures (cat.# 24498). |
| Notes | The column was stored in 100% acetonitrile when not in use. Columns are: Raptor Inert FluoroPhenyl (cat.# 9319A1E-T) Raptor FluoroPhenyl (cat.# 9319A1E) |
この実験結果から、イナートカラムを使用することで、6種類すべての分析対象成分においてピーク高さおよび面積の増加があったことが分かります。親化合物についてはピーク高さ・面積の増加は2～7%とわずかでしたが、ヒドロキシ代謝物では17～27%、カルボキシ代謝物ではさらに大きく31～39%と、特に代謝物で顕著な向上が見られました。とりわけカルボキシ化合物で検出感度が大きく向上したのは、カルボン酸官能基が金属表面と非特異的に結合しやすいことが主な要因と考えられます。一方、ヒドロキシ化合物や親化合物はより中性であるため、イナートカラムを使用したことによる影響は比較的限定的でした。これらの結果から、イナートカラムの導入はカンナビノイドの検出感度向上に有効であることが示唆されます。
全血中のカンナビノイド分析において低い検出限界の達成に課題がある場合、イナートLCカラムの導入は有効な選択肢となり得ます。生体液中のTHC異性体の分析に関心がある方は、さらなる情報を「全血・尿中THC異性体および代謝物の高感度LC-MS/MSメソッド」から、ぜひご確認ください。
