摘要
EPA 1634 草案主要用于水性基质（主要是雨水和地表水）中6PPD-醌的测定，是基于性能的一个LC-MS/MS方法。我们优化了分析柱和色谱条件，在满足EPA 1634方法规范的同时，提高分析效率，总运行时间从10min缩短到5.5min，为实验室提供了一种高效、可靠的解决方案。
引言
2023年12月根据《清洁水法案》（CWA），EPA 发布了1634 草案方法，使用液相色谱-串联质谱法（LC/MS/MS） 测定水性基质中的 6PPD-醌，以应对6PPD-醌渗入径流水的担忧。6PPD-醌是轮胎抗氧化剂6-PPD经臭氧氧化后的转化产物，它会随雨水径流进入水生生态系统，从而对银鲑和其它各种鱼类造成致命伤害。
EPA 1634 草案方法是一种基于性能的方法，这意味着如果结果被证明与既定方法规范等效，则可以对其进行更改。在这项研究中，除优化了分析柱和 LC-MS/MS 条件缩短运行时间外，在样品前处理过程中使用了性能更高的 Resprep HLB SPE 小柱，以确保更好的提取效果、较少基质干扰。
实验
标准品溶液
以乙腈为溶剂，配置 7 个不同浓度（具体见表 I）的标准品溶液，根据方法选择相对标准误差（%RSE） 最小的拟合曲线作为校正曲线。
表 I : 标准品溶液浓度
| Calibration Standard Concentrations (ng/mL) | |||||||
| Compound and Intermediate Standard Concentration | C1 | C2 | C3 | C4 | C5 | C6 | C7 |
| 6PPD-quinone (20 ng/mL) | 0.025 | 0.050 | 0.10 | 0.50 | 1.0 | 5.0 | 10.0 |
| 13C6-6PPD-quinone (20 ng/mL) | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| D5-6PPD-quinone (20 ng/mL) | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
QC 样品制备
根据EPA 1634草案方法第7.2节，用于精密度、准确度和方法检测限的QC样品的制备方法：在聚丙烯瓶中加入250mL去离子水后加入50μL提取和非提取内标物（EIS/NIS），标准品购自剑桥同位素实验室（货号分别为：CIL-ULM-12288-1.2、CLM-12293-1.2 和 DLM-11616-1.2）。用于初始精密度和回收率（IPR）的四个样品加入6PPD-醌的浓度为40ng/L；向6份MDL样品中加入50μL5：1稀释的天然标准品，得到预提取浓度为20ng/mL的样品。MDL样品在三天内制备、提取和分析。
水样
真实水样取自宾夕法尼亚州州立大学 322-东高速公路旁径流水，装在 250mL 琥珀玻璃瓶中，盖子带聚四氟乙烯内衬。样品在低于或等于6°C的温度下储存。所有样本均在采集后14天内提取。在样品提取前加入EIS，提取后加入NIS。
样品提取
在Dionex AutoTrace 280 PFAS 系统上使用 Resprep HLB SPE 小柱 （6 mL，60 μm，200mg HLB ，货号 #28264） 进行样品提取。具体提取步骤如图 1所示，在三天内提取完样品。提取后向样品中加入50 μL 未提取内标（NIS来自剑桥同位素实验室，货号DLM-11616-1.2）。
仪器方法
本研究使用Waters ACQUITY Premier LC和Xevo TQ Absolute三重四极杆质谱。表II 给出了 EPA 1634 草案方法的原始条件，本研究开发的优化色谱柱和条件如表III 所示。
表 II: EPA 1634 方法草案建议的HPLC条件（第10.3.1节）
| 色谱柱 | C18 phase 4.6 x 100 mm, 3.5 µm | ||
| 流动相 A | 水，0.2%甲酸 | ||
| 流动相 B | 乙腈 | ||
| 柱温 | 45 °C | ||
| 进样量 | 20 µL | ||
| 流速 | 0.6 mL/min | ||
| 最大压力 | 7500 psi (517 bar) | ||
| 梯度 | 时间 (min) | %A | %B |
| 0 | 90 | 10 | |
| 1 | 90 | 10 | |
| 3 | 45 | 55 | |
| 6 | 1 | 99 | |
| 8 | 1 | 99 | |
| 8.5 | 90 | 10 | |
| 9 | 90 | 10 | |
| 6PPD-醌预期洗脱时间 | 7.53 min | ||
| 总运行时间 | 10.0 min | ||
表 III : 优化后 LC 方法条件
| 色谱柱 | Raptor C18 50 x 2.1 mm, 2.7 µm (货号 9304A52) | ||
| 保护住 | Raptor C18 EXP柱套（25808）和柱芯 5 x 2.1 mm, 2.7 µm (货号 9304A0252) | ||
| 流动相 A | 水，0.1% 甲酸 | ||
| 流动相 B | 乙腈，0.1% 甲酸 | ||
| 溶剂 | 乙腈 | ||
| 柱温 | 40 °C | ||
| 进样量 | 3 µL | ||
| 流速 | 0.5 mL/min | ||
| 最大压力 | 3200 psi (220 bar) | ||
| 梯度 | 时间 (min) | %A | %B |
| 0 | 70 | 30 | |
| 3 | 0 | 100 | |
| 4 | 0 | 100 | |
| 4.01 | 70 | 30 | |
| 5.5 | 70 | 30 | |
| 6PPD-醌预期洗脱时间 | 1.93 min | ||
| 总运行时间 | 5.5 min | ||
结果和讨论
LC-MS/MS方法优化及色谱性能
由于EPA 1634 草案方法是基于性能的，因此只要仍然满足方法性能要求，实验室可以修改某些方法条件。在本研究中，我们优化了几个参数，以缩短运行时间，提高实验室通量，并创建了一种可用于HPLC和UHPLC平台的方法。我们的最终优化方法如图2所示，将6PPD-醌的保留时间从 7.53min缩短到 1.93min，将总运行时间从 10 min缩短到 5.5 min，最大背压约为220 bar。下面详细讨论了每个参数具体优化过程。
EPA 1634 草案方法使用 C18 作为分析柱，因此优化方法中选择的色谱柱为 Raptor C18，Raptor色谱柱是表面多孔颗粒（SPP/核壳颗粒）色谱柱，与原方法中3.5μm全多孔颗粒色谱柱相比，它具有效率高、运行时间短和背压低的特点。虽然草案方法使用粒径为 3.5μm，100 x 4.6 mm，但为了提高分析速度，优化方法时选择的色谱柱为2.7μm，50 x2.1 mm。另外分析柱前安装了Raptor C18 EXP保护柱（货号25808和9304A0252），以去除颗粒物延长分析柱使用寿命。
较小内径ID分析柱允许更快的运行时间，并且由于使用了较低的流速从而降低了背压和溶剂消耗量。尽管使用窄内径色谱柱缩短了运行时间，但早期洗脱基质与目标物分离良好，此外使用Resprep HLB SPE小柱进行样品制备，可以获得非常干净的样品提取物，从而进一步降低了基质干扰的风险。
因为选择了较小的柱尺寸，进样量从20μL减小到了3μL。减少进样量有几个好处：减少了引入的基质量可以改善色谱分离，延长柱寿命，减少基质效应，它还保存了样本，以防需要重新分析。
在方法优化过程中，我们比较了甲醇和乙腈（两者均含0.1%甲酸）作为有机相时的分离效果，两种有机相的结果都是可以接受的；我们最终选择乙腈作为有机相是因为避免样品稀释剂和起始流动相不匹配，以改善峰形并提高灵敏度。
因为使用较小内径色谱柱，洗脱梯度也与EPA 1634草案方法中描述的条件不同。优化后的梯度为6PPD-醌提供了充分的保留，并避免了早期洗脱基质对待测物的干扰。洗脱6PPD-醌后，在100%有机相B下又运行了3-4分钟，以冲洗柱中的高保留污染物，然后恢复到起始条件，因此色谱柱在两次进样之间进行了有效地再平衡。所开发的方法的最大背压220 bar，可用于HPLC和UHPLC系统。
LC_EV0600
Peaks
| Peaks | tR (min) | Conc. (ng/mL) | Precursor Ion | Product Ion 1 | Product Ion 2 | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1. | 6PPD-Quinone (6PPD-Q) | 1.93 | 2.8 | 299.22 | 215.07 | 241.08 |
| 2. | 6PPD-Quinone-D5 (6PPD-Q-D5) | 1.93 | 1 | 304.28 | 220.08 | – |
| 3. | 6PPD-Quinone-13C6 (6PPD-Q-13C6) | 1.93 | 1 | 305.28 | 221.19 | – |
Conditions
| Column | Raptor C18 (cat.# 9304A52) | ||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Dimensions: | 50 mm x 2.1 mm ID | ||||||||||||||||||||||||
| Particle Size: | 2.7 µm | ||||||||||||||||||||||||
| Pore Size: | 90 Å | ||||||||||||||||||||||||
| Guard Column: | Raptor C18 EXP guard column cartridge 5 mm, 2.1 mm ID, 2.7 µm (cat.# 9304A0252) | ||||||||||||||||||||||||
| Temp.: | 40 °C | ||||||||||||||||||||||||
| Standard/Sample | |||||||||||||||||||||||||
| Diluent: | Acetonitrile | ||||||||||||||||||||||||
| Inj. Vol.: | 3 µL | ||||||||||||||||||||||||
| Mobile Phase | |||||||||||||||||||||||||
| A: | 0.1% Formic acid, water | ||||||||||||||||||||||||
| B: | 0.1% Formic acid, acetonitrile | ||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||
| Max Pressure: | 220 bar |
| Detector | Waters Xevo TQ-S |
|---|---|
| Ion Mode: | ESI+ |
| Instrument | Waters ACQUITY Premier |
| Sample Preparation | Runoff water was collected from roadway 322-East, located in State College, PA, U.S. One-half milliliter of an extracted internal standard (EIS) solution (20 ng/mL of 6PPD-Q-13C6) was added to 250 mL of sample. Resprep Polymeric SPE cartridges, HLB (cat.# 28264), and a Thermo AutoTrace PFAS instrument were used for the following sample preparation procedure (steps 1-6 were diverted to waste): 1. Wash each cartridge with 5 mL of acetonitrile. 2. Wash each cartridge with 5 mL of reagent water. 3. Add 5 mL of reagent water to each cartridge. 4. Add the sample to the SPE column (250 mL) at a flow rate of 10-15 mL/min until the entire sample has been loaded onto the column. 5. Rinse the sample bottle with 5 mL of 50:50 methanol:reagent water (v/v) and then pour onto the column reservoir. 6. Once the rinse has completely passed through the cartridge, dry the cartridge under nitrogen for at least 5 minutes. 7. Rinse the sample bottles with 5 mL of acetonitrile and collect the SPE eluent using 15 mL polypropylene tubes. Samples should be pulled through using a low vacuum such that the solvent exits the cartridge in a dropwise fashion. 8. Repeat step 7 with a second 4-5 mL aliquot of acetonitrile. The total volume collected should be ~9-10 mL. 9. Add 0.5 mL of the non-extracted internal standard (NIS) solution (20 ng/mL of 6PPD-Q-D5) to the sample extract and vortex. 10. Transfer an aliquot of the sample to a screw-thread polypropylene autosampler vial (cat.# 23243) and cap with a polypropylene screw-thread cap (cat.# 24486). |
线性
如图3所示，优化的方法在0.025-10 ng/mL的校准范围内产生了良好的线性，RSE=3.77%，完全在<20%的方法规范范围内。此处评估RSE而不是r2，因为EPA 1634草案方法规定：“相关系数r和决定系数r2不再被视为线性的适当指标，不应与本方法结合使用[1]。”
IPR
通过重复进样分析四个40ng/L的加标样品测得准确性和精确性，结果如表 IV 所示：平均回收率为95.00%，RSD为4.00%。EPA 1634 草案方法规定回收率必须在70-130%范围内，RSD必须<20%，因此这些结果完全在方法规格范围内。
表 IV: IPR 数据 (浓度为40 ng/L的加标样品 [n = 4])
| Sample # | Recovery (ng/L) | Recovery (%) |
| 1 | 40.1 | 100% |
| 2 | 38.3 | 95.80% |
| 3 | 35.8 | 89.50% |
| 4 | 37.8 | 94.50% |
方法检测限（MDL）和最低定量水平（ML）
为了建立 MDL 和 ML，根据草案方法在 3 天内提取了 6 个重复样品。将加标和空白结果的标准偏差乘以t值3.143，选择加标和空白之间结果的较高者作为MDL。在第20.2节中，EPA 1634 草案方法规定“ML可以通过将MDL（合并或非合并, 视情况而定）乘以3.18并将结果四舍五入到最接近1、2或5 x 10n的数字来获得，其中n为零或整数[1]。“在我们的研究中，MDL（非合并）为0.285 ng/L，ML为1 ng/L（表V）。
表 V: 去离子水中 6-PPD-醌的MDL和ML值
| MDL (ng/L) | ML (ng/L) |
| 0.285 | 1 |
EIS and NIS
如表VI所示，EIS的平均回收率为82.2%，RSD为5.6%。对于NIS，平均回收率为117.8%，RSD为1.9%。
表 VI: 内标回收率(n = 17)
| Compound | Avg. % Recovery | %RSD |
| EIS | 82.2% | 5.6% |
| NIS | 117.8% | 1.9% |
径流水
表VII 中显示的数据表明，强化去离子水和径流水的回收率在方法规定范围内（70-130%）。此外，与未强化的去离子水相比，未强化的径流水对 6PPD 醌的反应高出约 30%，表明 6PPD-醌存在于收集基质样品的位置，但水平低于定量限。
表 VII: 基质回收率（40 ng/L）
| Matrix | %Recovery |
| DI water | 100.70% |
| Runoff water | 95.50% |
结论
EPA 1634草案方法概述了使用LC/MS/MS 分析水性基质（主要是雨水和地表水）中的6PPD-醌。由于它是一种基于性能的方法，因此只要满足方法要求，就可以进行更改。本研究的重点是开发一种优化的LC-MS/MS 方法，以加快分析速度并提高实验室的样品通量。根据EPA 1634草案方法使用Dionex AutoTrace 280 PFAS 系统进行样品制备和萃取，并采用优化的 LCMS/MS方法，该研究获得了以下结果。校准范围为0.025–10 ng/mL，%RSE为3.77%。EIS（13C6-PPD-醌）的平均回收率为 82.2% （n = 17），RSD 为 5.6%，而 NIS（D5-6-PPD-醌）的平均回收率为 117.8%，RSD 为 1.9%。方法检测限(MDL)为0.285ng/L，相当于ML 为 1 ng/L。当IPR 加标浓度为 40 ng/L 时，平均回收率为 95.0%，RSD 为 4.0%。加标浓度为 40ng/L 的基质样品的回收率为 95.5%，而去离子水加标的回收率为 100.7%。所有结果均达到或超过该方法的规格。除上述结果外，优化的HPLC 方法还能够将总运行时间从 10 min缩短至 5.5 min，从而将 6PPD-醌的洗脱时间从 7.5min缩短至 1.9min。优化后的方法还减少了进样体积并保持了低背压，因此可以在HPLC 和 UHPLC 仪器上运行。
致谢
作者感谢 Grayson Ritch、Diego López 和 Colton Myers 对这项工作的贡献。
参考文献
1. U.S. Environmental Protection Agency, Draft Method 1634, Determination of 6PPD-quinone in aqueous matrices using liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC MS/MS), December 2023. https://www.epa.gov/system/files/documents/2025-02/draft-method-1634_1-24-24_508.pdf
